非編碼RNA與創面愈合的研究進展

宋建坤，蒯仂 ，茹意，羅楹，迮侃，李福倫，李欣，孫曉穎，李斌

(1.上海中醫藥大學，上海 201203； 2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院皮膚科，上海 200437)

皮膚是保護人體免受外界傷害的外在屏障，由表皮、真皮及皮下三層構成。皮膚受損后，真皮細胞對不同水平調控過程的協同作用是必不可少的[1]。創面愈合主要經歷兩個階段：炎癥期，各種炎癥細胞浸潤到傷口部位，清除病原體，分泌細胞因子和生長因子[2]；修復期，創面細胞外基質開始重建，包括血管生成、肉芽組織形成、膠原纖維沉積、上皮化和創面收縮，接著瘢痕組織成熟，Ⅲ型膠原被Ⅰ型膠原取代，創面愈合[3-4]。全基因組的轉錄組學研究表明，人類基因組被大量的非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)廣泛轉錄，包括微RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和環狀RNA(circular RNA，circRNA)[5]。ncRNAs是近年來發現的對細胞生理學和病理學具有重要作用的基因調控因子。ncRNAs占人類細胞轉錄產物的近60%，在發育和病理環境中ncRNA被證明可以調節細胞過程和通路[6]。ncRNAs參與創面愈合的全過程，研究ncRNAs與創面愈合之間的相互關系有助于更好地了解其在創面愈合中對信號通路的作用及調控機制，并為創面治療提供新靶點。現就ncRNAs與創面愈合的研究進展予以綜述。

1 miRNA與創面愈合

miRNA是一類在物種進化中相當保守，長度為18～25個核苷酸序列的小分子單鏈RNA。miRNA的轉錄初產物在細胞核內轉錄，被核糖核酸酶-脫氧核糖核酸酶切割成前體miRNA。輸出蛋白5將前體miRNA運輸到細胞質中，進一步切割形成成熟miRNA。之后，miRNA與RNA誘導沉默復合體結合形成siRNA誘導基因沉默復合物——miRNA復合物，作為翻譯抑制劑降解靶mRNA，在轉錄后水平負性調控靶基因的表達。

1.1miRNA在創面炎癥期的作用 炎癥反應是愈合創面的首要條件，miRNA異常表達影響促炎與抗炎信號的精細調節，導致創面促炎/抗炎信號失衡，引起過度的慢性炎癥影響創面愈合。慢性炎癥反應也會影響角質形成細胞介導的上皮化進程(角質形成細胞的增殖、遷移等)，不利于啟動后續的組織修復程序。在創面愈合的炎癥階段，白細胞通過受損的血管進入傷口，這是一種由化學引誘物介導的過程，如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血小板衍生生長因子等。參與創面炎癥期的miRNA主要有miR-155、miR-21、miR-146、miR-223、miR-203等。其中促進炎癥反應的為miR-155，抑制炎癥反應的有miR-21、miR-146、miR-223、miR-203。

miR-155是最早與Toll樣受體配體、炎癥細胞因子和特異性抗原誘導的炎癥相關的miRNA之一。Yang等[7]在創面邊緣注射miR-155拮抗劑，發現促炎因子白細胞介素(interleukin,IL)-1β、TNF-α減少，抗炎因子IL-10增加，下調miR-155可能通過減少難愈合創面過度的炎癥反應，提高創面愈合質量。

miR-21是人類疾病中最常見的上調miRNA之一，在細胞增殖、分化、凋亡和上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)中發揮重要作用。miR-21促進成纖維細胞遷移，并使得生長因子分泌及其他細胞類型向創面遷移，從而加速糖尿病創面愈合過程[8]。Das等[9]研究發現巨噬細胞中miR-21的高表達促進了靶基因人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的磷酸酶和重組人程序性細胞死亡4的分泌和沉默，誘導巨噬細胞產生更多的抗炎細胞因子IL-10，同時抑制炎癥介質(TNF-α)的釋放，促進創面凋亡細胞清除，加速創面愈合。

miR-146是巨噬細胞和樹突狀細胞中細胞因子和病原體產物(如脂多糖)誘導的miRNA之一。研究發現，miR-146a/b通過靶向泛素連接酶TNF受體相關因子6和IL-1受體相關激酶1負調控樹突狀細胞凋亡，減少促炎細胞因子IL-6、TNF-α的表達，抑制炎癥的發展[10]。Xu等[11]研究發現miR-146a的低表達與糖尿病潰瘍創面異常炎癥反應有關。Zhou等[12]研究發現吞噬細胞和上皮細胞中的miR-223協同抑制上皮細胞中的經典核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途徑，減少促炎因子和趨化因子的釋放，從而起到控制炎癥的作用。

TNF-α和IL-24是角質形成細胞系和原代角質形成細胞中miR-203的直接靶標，miR-203通過下調細胞因子信號轉導抑制蛋白基因家族成員以及促炎細胞因子來微調或平衡細胞因子信號，創傷皮膚中miR-203的增加可能是抗炎反應的一部分[13]。Benakanakere等[14]研究發現，上皮細胞表面Toll樣受體2的表達受miR-105表達的負調控，該機制可能降低炎癥細胞因子的產生，減少炎癥反應。

1.2miRNA在創面修復期的作用 創面修復期主要包括增殖和重塑兩個階段。增殖階段主要涉及再上皮化和血管生成，重塑階段與膠原蛋白的沉積至關重要。

1.2.1miRNA在增殖階段的作用 在傷口愈合的情況下，EMT由細胞因子如TGF-β驅動，并且是角質形成細胞向創面中心遷移所必需的。在正常的傷口愈合中，該過程導致再上皮化。參與這一過程的miRNA主要有miR-21、miR-31、miR-155、miR-203、miR-204、miR-205、miR-210等。其中促上皮化的有miR-21、miR-31、miR-155，抑制上皮化的有miR-203、miR-204、miR-205、miR-210。

Yang等[15]研究發現，miR-21可能通過抑制組織金屬蛋白酶抑制因子3和T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1的表達，促進角質形成細胞在體外遷移，促進創面在體內愈合。Li等[16]研究發現miR-31在傷口邊緣化細胞中表達上調，通過抑制其靶基因上皮膜蛋白1，促進角質形成細胞增殖和遷移。此外，miR-31還能通過靶向Ras/促分裂原活化的蛋白激酶信號通路促進角質形成細胞遷移和增殖，因此miR-31是皮膚創面角質形成細胞從炎癥階段向再上皮化階段轉變的重要細胞內在調控因子[17]。miR-155通過上調基質金屬蛋白酶-2的水平，加速角質形成細胞的遷移，促進創面愈合和再上皮化，且不影響創面收縮[18]。

miR-203是表皮中最豐富的角質形成細胞特異性miRNA，具有抗增殖作用。miR-203直接靶向轉錄因子p63，通過限制表皮干/祖細胞和角質形成細胞的增殖潛能和誘導細胞周期退出，促進表皮分化[19]。Deppe等[20]研究證實,下調miR-203可以加快角質形成細胞增殖和遷移的靶蛋白的表達，以改善損傷皮膚的再上皮化。miR-204在角膜上皮中高表達，但是在角膜創面愈合過程中表達下調。因此，下調miR-204可以促進上皮細胞的增殖和遷移，利于創面愈合[21]。miR-205在角質形成細胞遷移、再上皮化過程中起重要作用。有報道顯示，miR-205的下調導致絲氨酸-蘇氨酸激酶1的活性增加，肌動蛋白切斷絲切蛋白的磷酸化，以及絲狀肌動蛋白的相應減少，抑制角質形成細胞的遷移，延長創面的愈合[22]。Biswas等[23]發現在缺血性創面中出現大量缺氧誘導因子-1α，誘導miR-210表達，導致細胞周期調節蛋白E2F3表達下調，限制細胞增殖。在創面愈合過程中，miR-210下調可促進角質形成細胞的增殖，加快創面的閉合。

血管生成是增殖階段的另一個特征。創面的血管分布與其愈合能力密切相關，通過在整個傷口愈合過程中提供支持組織再生的營養物，促進血管生成，對傷口愈合及預后至關重要。促血管生成的miRNA主要有miR-146a、miR-4530、miR-148b、miR-23a、miR-126、miR-424等。抑制血管生成的miRNA有miR-218、miR-200b、miR-1、miR-29b、miR-939、miR-21、miR-377等。

miR-146a除抑制促炎細胞因子釋放外，還能增強血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。研究發現miR-146a通過靶向p21激活激酶1基因，刺激VEGF表達和血管分支的形成，促進新生血管的形成[24]。miR-4530具有刺激內皮細胞血管生成的能力。Zhang等[25]研究發現miR-4530可能通過抑制乳腺癌細胞中血管生成抑制蛋白的表達，從而促進血管再生。Miscianinov等[26]研究顯示，在內皮細胞中miR-148b具有促進血管生成的重要作用，其抑制作用通過調控靶基因TGF-β2和母親DPP同源物2(果蠅)(Smad)促進內皮-間充質轉化的過程。上調miR-148b可增加內皮細胞的遷移、增殖和血管生成，加速創面的閉合，下調miR-148b可上調創面內皮-間充質轉化表達，使得創面閉合受損。miR-23a通過抑制脯氨酰羥化酶1和2導致內皮細胞中缺氧誘導因子-1α的積累，促進血管生成。同時，miR-23a還抑制緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白，從而增加血管通透性，上調miR-23a可以促進血管再生，加快創面愈合[27]。Jansen等[28]發現miR-126通過內皮細胞微粒轉運到受體人冠狀動脈內皮細胞中，并調控靶蛋白SPRED1(EVH1 domain-containing protein 1)，促進血管內皮細胞的修復。miR-424靶向通過靶向Cullin 2蛋白，增加缺氧誘導因子-1α在細胞內的水平，抑制其蛋白酶體降解。升高的缺氧誘導因子-1α增加VEGF和人源葡萄糖轉運蛋白的轉錄，表明上調miR-424可以促進血管形成[29]。

Zhang等[30]發現miR-218可能通過靶向ROBO1(細胞黏附分子免疫球蛋白超家族成員)基因介導血管叢破壞，抑制腫瘤的生長。同樣地，在創傷愈合過程中，下調miR-218的表達能促進血管生成。miR-200家族通過控制細胞遷移和極性，在EMT過程中起重要作用。Chan等[31]發現miR-200b負調控人微血管內皮細胞中的Ets-1相關基因，即基質金屬蛋白酶-1和VEGF受體2，下調miR-200b能夠促進血管生成。miR-21能夠抑制內皮細胞的增殖和遷移，是一種強有力的抗血管生成因子[32]。Xie等[33]研究發現下調miR-1可以激活血管生成前信號通路，促進VEGFA的表達，刺激血管內皮細胞的增殖和遷移。有研究報道，miR-29b通過靶向蛋白激酶3抑制乳腺癌細胞中VEGF和c-myc的表達，證明了miR-29b在抗血管生成和抗腫瘤發生中的作用[34]。另一項研究表明miR-29b的過表達通過靶向信號轉導及轉錄激活因子3信號通路抑制宮頸癌細胞的體外侵襲、EMT過程和血管生成，抑制腫瘤生長和體內新生血管形成[35]。在創面愈合過程中，miR-29可能通過靶向蛋白激酶3和信號轉導及轉錄激活因子3信號通路抑制新生血管生成。miR-939在人臍靜脈內皮細胞過表達顯著抑制細胞增殖、黏附和成管，通過直接靶向γ聯蛋白來消除血管完整性并抑制血管生成[36]。在創面愈合中，下調miR-939可以促進內皮細胞增殖和血管生成。體內外的研究均證實過表達miR-377可以抑制食管癌的生長和血管生成[37]。同樣，下調miR-377可能通過直接結合其3′非編碼區來調節CD133和VEGF，促進血管形成。

1.2.2miRNA在重塑階段的作用 傷口愈合的重塑階段涉及組織的膠原沉積，與瘢痕的形成和成熟密切相關。Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ,Col1)是細胞外基質的主要組成部分，其無序積累可導致瘢痕形成。參與重塑階段的miRNA主要有miR-98、miR-141-3p、miR-29b、miR-185等。

Bi等[38]用miR-98模擬物轉染成纖維細胞后，Col1α1基因表達顯著下降，導致細胞活力下降和細胞凋亡增加，用miR-98抑制劑轉染細胞，結果相反。因此，下調miR-98可以促進皮膚成纖維細胞中的Col1α1基因表達，加快創面愈合。生長因子受體結合蛋白2相關的接頭蛋白1是miR-141-3p的直接靶點，其在瘢痕組織中表達上調。研究發現miR-141-3p通過抑制接頭蛋白1表達降低皮膚成纖維細胞的增殖和遷移，促進細胞凋亡，下調miR-141-3p誘導成纖維細胞分泌膠原，促進創面愈合[39]。miR-29b及其家族成員(miR-29s)主要通過調節細胞外基質代謝參與創傷愈合和組織纖維化，通過抑制TGF-β1/Smad/結締組織生長因子信號轉導途徑，減少過度瘢痕形成[40]。Zhu等[41]研究發現miR-29b可能通過轉錄后抑制熱激蛋白47的表達，在皮膚創傷愈合過程中降低膠原合成和血管生成。因此，下調miR-29b能誘導膠原合成，促進創面愈合。Xiao等[42]研究發現過表達的miR-185可以抑制成纖維細胞的生長，其潛在機制可能是通過抑制TGF-β1和Col1的表達來介導的。

2 lncRNA與創面愈合

lncRNAs是一類長度超過200個核苷酸的非蛋白編碼轉錄本。由于具有結合DNA、RNA和蛋白質的能力，其作用機制可大致分為：①轉錄活性的分子信號；②內源誘餌結合并降低其他調節RNA的可用性或蛋白質；③指導染色質修飾復合物定位到靶DNA；④蛋白質和轉錄物結合的結構支架[43]。

2.1lncRNA在創面炎癥期的作用 參與創面炎癥期相關分子(如NF-κB、TNF-α、IL-6)表達調控的lncRNA主要有lncRNA-環加氧酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)、Lethe、肺腺癌轉移相關轉錄子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)、lnc1992 THRIL、lnc-IL7R等。其中促進炎癥反應的有lncRNA-COX2，抑制炎癥反應的有Lethe、MALAT1、lnc1992 THRIL、lnc-IL7R。

Hu等[44]發現lncRNA-COX2在活化的巨噬細胞中的作用機制涉及形成含有lncRNA-COX2的染色質重建復合物，所得到的復合物被募集到晚期炎癥基因的啟動子/增強子區域，調節NF-κB向復合物的募集，觸發染色質重塑，并最終導致獲得NF-κB結合和基因轉錄的位點。

Lethe是一種假基因lncRNA，受NF-κB亞基RelA[v-rel網狀內皮增生病毒癌基因同源物(禽)]調控。在小鼠胚胎成纖維細胞中，lncRNA Lethe可能通過直接與RelA同源二聚體結合，阻斷RelA結合DNA的能力，從而起到抑制NF-κB的效應，發揮抗炎作用[45]。MALAT1是一種高度保守的lncRNA，敲除MALAT1可以增加脂多糖誘導的TNF-α和IL-6的表達[46]。在細胞核中，MALAT1與NF-κB的亞基p65和p50相互作用以抑制其DNA結合活性，從而減少促炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達，抑制炎癥的發生[46]。lnc1992 THRIL又稱TNF-α和異構核L核糖核蛋白相關的免疫調節lncRNA，它可以調節人類巨噬細胞對先天刺激的反應。THRIL通過感應TNF-α、IL-6、IL-8和CXC趨化因子配體10的表達調節Toll樣受體1/2激動劑的效能，Toll樣受體1/2激動劑受到刺激后，THRIL通過與人源全長重組蛋白形成RNA蛋白復合物，負調控TNF-α表達[47]。

lnc-IL7R能夠減少脂多糖誘導的炎癥反應，對血管細胞黏附分子-1、IL-6及IL-8具有負調節作用，通過削弱組蛋白H3的N端賴氨酸殘基K27甲基化，從而阻斷炎癥介質的近端啟動因子對炎癥反應進行調節[48]。

2.2lncRNA在創面修復期的作用

2.2.1lncRNA在增殖階段的作用 創面增殖期以血管內皮細胞增殖與角質形成細胞的增殖和遷移為主要表現。參與增殖階段的lncRNA主要有MALAT1、LINC00323-0、lncRNA-H19、lncRNA ANRIL(antisense non-coding RNA in the INK4 locus)、母系表達基因3(materally expressed gene 3，MEG3)等。其中促上皮化的有MALAT1、LINC00323-003、lncRNA-H19、lncRNA ANRIL，抑制上皮化的有MEG3。

MALAT1由TGF-β誘導，是內皮細胞增殖的重要介質。在體外與體內實驗中，抑制內皮細胞中MALAT1均可減少內皮細胞的增殖，導致血管生長缺陷，表明MALAT1對內皮細胞、血管生成具有促進作用[49]。缺氧是一種強有力的促血管生成刺激物，并在內皮細胞中誘導VEGF介導的信號轉導。LINC00323-003對缺氧高度敏感，對內皮細胞的血管生成至關重要，下調lncRNA會導致離體誘導的基于多能干細胞的三維工程人心臟組織模型中的血管形成受損[50]。Tao等[51]發現lncRNA-H19的降低與糖尿病血管生成損傷之間可能存在通過阻斷lncRNA-H19而導致胰島素-磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B通路受損的關系。Zhang等[52]發現過表達的lncRNA ANRIL通過激活NF-κB信號轉導途徑上調VEGF并促進血管生成。

MEG3是一種母系印跡基因編碼的lncRNA，Su等[53]發現MEG3水平與VEGF水平呈負相關，提示MEG3可能通過p53途徑抑制VEGF的表達。因此，下調MEG3可以促進血管生成。

2.2.2lncRNA在重塑階段的作用 在這一階段，成纖維細胞合成膠原纖維尤為重要，TGF-β、IL-4對膠原合成有明顯的促進作用[54]。參與調控膠原合成及瘢痕形成的lncRNA主要有lncRNA8975-1、lncAC097662.2、lncRP11-586K2.1、lncRNA8975-1、lncRNA Col1α2-AS1等。

lncRNA8975-1、AC097662.2和RP11-586K2.1分別與Col1α2、Col4α3和基質金屬蛋白酶-16基因相關，參與趨化因子和TNF信號通路，可能影響膠原蛋白的合成或降解[55]。lncRNA AC067945.2的過表達下調皮膚成纖維細胞中的膠原蛋白表達，并可能與VEGF和Wnt信號通路相關[56]。Li等[57]通過實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應分析發現lncRNA8975-1 在增生性瘢痕組織和真皮成纖維細胞中過表達。lncRNA8975-1過表達抑制增殖性瘢痕成纖維細胞中Col1α2、Col1α1、Col3α1和α-平滑肌肌動蛋白的細胞增殖并降低其蛋白表達水平，表明下調lncRNA8975-1可以促進成纖維細胞的增殖。Nong等[58]研究發現lncRNA Col1α2-AS1在增生性瘢痕組織和成纖維細胞中上調，通過促進Smad7表達抑制成纖維細胞增殖，同時也證實了miR-21參與lncRNA Col1α2-AS1誘導的Smad7表達，Col1α2-AS1作為內源性海綿吸附miR-21，進而調節Smad7和分子級聯，在增生性瘢痕中發揮保護作用。

3 circRNA與創面愈合

circRNA是由mRNA前轉錄本的非序列反剪接形成的，在真核細胞中廣泛表達。它們最近被確定為多種生理和病理過程中的關鍵調節因子，通常作為miRNA海綿起作用，并參與miRNA介導的轉錄后調控網絡的組成。此外，circRNA還具有與RNA結合蛋白相互作用、調節mRNA的穩定性、調控基因轉錄、翻譯蛋白等功能。

3.1circRNA在創面炎癥期的作用 circRNA 0044073、circARF3、circRNA_Atp9b是具有促炎作用的circRNA，下調其表達有利于減少創面炎癥反應。

circRNA 0044073的過表達促進了人血管平滑肌細胞和血管內皮細胞的增殖，有利于Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子信號轉導途徑和炎癥的激活[59]。有證據顯示，Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子信號通路通過IL家族、干擾素家族及生長抑素影響巨噬細胞、T細胞，從而參與創傷愈合過程。circARF3作為內源性miR-103海綿起到抑制miR-103活性的作用，導致TNF受體相關因子3表達增加，而TNF受體相關因子3能夠阻斷NF-κB信號轉導途徑，促進NOD樣受體蛋白3炎癥小體激活和炎癥細胞因子釋放[60]。Zhou等[61]用IL-1β刺激小鼠軟骨細胞后，發現circRNA_Atp9b表達顯著上調，敲低circRNA_Atp9b則促進了Ⅱ型膠原的表達，同時抑制了基質金屬蛋白酶-13、COX-2和IL-6的產生，表明circRNA_Atp9b通過海綿miR-138-5p調控細胞外基質分解代謝和炎癥。

3.2circRNA在創面修復期的作用

3.2.1circRNA在增殖階段的作用 circANRIL與雌激素受體共調節因子抗體同源物1結合，損害核酸外切酶介導的前核糖體RNA加工和血管平滑肌細胞和巨噬細胞中的核糖體生物合成。研究顯示，circANRIL可誘導核仁應激和p53活化，進而增加細胞凋亡，降低增殖率[62]。

功能性研究發現，上調circRNA-肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MYLK)可以促進細胞增殖和遷移，在體內外誘導EMT和血管生成，而下調circRNA-MYLK則相反。在機制上，circRNA-MYLK和VEGFA的非編碼區具有相同的miR-29a反應元件，與miR-29a競爭性結合，通過拮抗miR-29a調控VEGFA的表達[63]。VEGFA還通過激活TGF-β信號，NF-κB和β聯蛋白途徑促成EMT的發生。因此，上調circRNA-MYLK可以促進細胞增殖和血管生成，加快創面的修復。

3.2.2circRNA在重塑階段的作用 實驗表明，circRNA_010567沉默可以上調miR-141，下調TGF-β1的表達，并抑制成纖維細胞中纖維化相關蛋白切除，包括Col1、Col3和α-平滑肌肌動蛋白，因此上調circRNA_010567可以促進膠原生成[64]。Yang等[65]通過動物實驗、聚合酶鏈反應和細胞遷移實驗等發現circ-Amotl1的表達加速了成纖維細胞的增殖和遷移，進一步的機制研究發現異位circ-Amotl1可以增加信號轉導及轉錄激活因子3和DNA甲基轉移酶3A的蛋白水平，增加纖維連接蛋白的表達，從而促進創面的愈合。

4 展 望

人類基因組大多是由ncRNAs組成，ncRNAs在創面愈合過程中扮演重要角色，參與調節炎癥反應、再上皮化、血管生成和瘢痕形成，有望成為創面愈合的生物標志和治療靶點。目前miRNA在創面愈合中的機制研究相對成熟，而lncRNA與circRNA對創面愈合的調控機制尚處于初始階段，有待進一步體內外實驗及功能驗證。進一步研究ncRNAs在創傷愈合中各個階段的作用，并篩選其靶基因，將成為研究者今后努力的目標。更好地理解創傷愈合的分子機制可能為慢性創面提供更好的治療和先進的解決方案。