DNA高甲基化在臨床常見疾病中的作用及5-氮胞苷干預的基礎研究

劉佳嘉，張程，，張湘燕

(1.遵義醫科大學，貴州 遵義 563000； 2.貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科，貴陽 550002)

表觀遺傳學是當今醫學研究一大熱點，DNA甲基化是其重要組成部分。作為DNA化學修飾的一種形式，DNA甲基化在不改變DNA序列的前提下能改變遺傳表現，其可塑性及調節基因表達作用強，因而在疾病的發生、發展中有重要作用。DNA高甲基化對轉座因子的沉默、病毒序列的防御及某些基因的轉錄抑制具有多方面的作用。去甲基化劑通過重新激活腫瘤抗原表達、抗增殖狀態、逆轉錄病毒序列、改變細胞信號轉導途徑和凋亡閾值等多方面效應發揮效力，因此化學抑制劑形式的藥物干預似乎成為目前對不適當沉默基因進行去抑制和恢復正常功能的可靠方法之一。5-氮胞苷是目前最主要的DNA甲基轉移酶抑制劑，在DNA復制過程中摻入DNA并捕獲DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)隨后將其靶向用于蛋白質降解；含有5-氮胞苷的DNA在第一輪DNA復制后被半甲基化，并在數輪復制后變得完全脫甲基，從而使沉默的表觀遺傳修飾切換到活躍狀態。由于5-氮胞苷強烈的去甲基化作用，已經引起了臨床的廣泛關注。許多研究已經證實了5-氮胞苷的抗腫瘤作用或輔助治療作用[1-5]，并且部分應用于臨床。現就DNA高甲基化在常見臨床疾病中的作用及5-氮胞苷在基因干預的基礎研究進展予以綜述。

1 DNA高甲基化在臨床常見疾病中的作用

1.1DNA高甲基化 DNA甲基化是最常見的表觀修飾之一，由DNMT催化，作為甲基供體的腺苷甲硫氨酸在基因組CpG二核苷酸上通過胞嘧啶環的5′位置添加甲基，從而產生5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5 mC)[6-7]。一般認為，只有位于CpG二核苷酸中的C才能夠被甲基化，CpG二核苷酸的集中區域稱為CpG島。哺乳動物基因組中廣泛存在CpG DNA甲基化，約70%的CpG二核苷酸被甲基化[7]。這些富含CpG啟動子的DNA甲基化對轉座因子的沉默和某些基因的轉錄抑制具有多方面作用。由于DNA甲基化的可塑性和在調節基因表達中的關鍵作用，整個基因組中的DNA甲基化模式在發育過程中經歷了重大變化，并成為調節重要生物途徑的工具。DNA甲基化影響人類基因組的效果包括轉錄抑制、染色質結構修飾和X染色體失活、基因組印跡、抑制重復序列以及寄生DNA成分對基因組完整性的損害作用等[8]。甲基化模式的維持對于細胞存活、正常胚胎、出生后發育以及成人正常生理功能必不可少。在正常情況下，通常并不是CpG島中所有CpG都發生甲基化，高于正常狀態下甲基化水平稱之為高甲基化。基因高甲基化通常引起基因沉默，一般來說，DNA甲基化程度越高，這段DNA被轉錄成RNA并翻譯成有功能蛋白質的可能性越小[9]。

1.2DNA高甲基化在臨床常見疾病中的作用 表觀遺傳學是當今醫學研究的一大熱點，越來越多的證據表明，DNA高甲基化在腫瘤、自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等常見臨床疾病中有重要作用[10]。

1.2.1DNA高甲基化在腫瘤中的作用 DNA高甲基化是腫瘤抑制基因在癌癥中沉默的一種機制。早期的證據表明，在癌細胞中，DNMT活性增加使腫瘤抑制基因啟動子區域甲基化水平增高，導致沉默相關蛋白過度表達，從而使癌細胞增殖[11]。因而DNA高甲基化在癌癥的發生、發展中起重要作用，同時也為癌癥的早期診斷提供了生物標志物。單個基因座的高甲基化與不止一種癌癥密切相關，沒有單一的高甲基化基因可以用作癌癥特異性生物標志物。例如，Ras相關結構域家族蛋白(Ras-association domain family，RASSF)啟動子高甲基化與幾種癌癥相關，如膀胱癌、子宮內膜癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、腎癌等；RARB基因啟動子的高甲基化致基因失活，與肺癌、乳腺癌和前列腺癌有關；RASSF1A顯示出抑制細胞增殖、控制細胞周期和促進細胞凋亡的潛力，其啟動子區域高甲基化引起抑癌細胞增殖功能失活，與肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、鼻咽癌等不同類型的癌癥有關[12]。O6甲基胍脫氧核糖核酸甲基轉移酶(O-6-methyguanine deoxyribonucleic acid methyltransferase，MGMT)基因啟動子高甲基化與各種癌癥腫瘤組織中MGMT表達缺失或減少相關，包括肺癌、胃癌和食糜性腫瘤等[13]。同時，也有證據支持多種基因的高甲基化與癌癥的特異性類型有關[11]，表明許多特定的基因可以用來為某種癌癥類型提供診斷，因此，生物標志物的數量將會更大。Zou等[14]發現，死亡相關蛋白激酶、Runt相關轉錄因子3和MGMT的高甲基化在胃癌的發病機制中起共同作用；膀胱癌患者中RASSF1、上皮鈣黏素、死亡相關蛋白激酶及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A均呈高甲基化狀態；以類似的方式，乳腺癌患者出現RARB、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因、結腸腺瘤性息肉病基因、乳腺癌易感基因的高甲基化狀態，而非小細胞肺癌患者出現MGMT、脆性組氨酸三聯體基因、錯配修復基因1高甲基化狀態。

1.2.2DNA高甲基化在自身免疫性疾病中的作用 自身免疫性疾病是指在某些因素刺激下，機體的免疫系統對自身抗原產生免疫應答，形成自身抗體而導致機體受損所引起的疾病。目前對自身免疫性疾病的發病機制仍知之甚少，臨床上均采用相同的免疫抑制劑治療不同的自身免疫疾病，治療方法缺乏特異性。越來越多的證據表明，DNA高甲基化可以使某些與黏附因子及細胞因子相關的基因異常表達，使T細胞、B細胞的自身反應性發生改變，從而與自身免疫性疾病發病密切相關[15-17]，有望為自身免疫性疾病的治療提供新思路。

1.2.2.1DNA高甲基化在1型糖尿病中的作用 糖尿病是由胰島素分泌和(或)作用缺陷引起的代謝性疾病，分為1型糖尿病和2型糖尿病，其中1型糖尿病又稱為胰島素依賴型糖尿病，是由機體內T淋巴細胞介導的自身免疫反應引起胰島β細胞破壞，從而不能正常分泌胰島素導致胰島素絕對缺乏[18]。Husseiny等[19]研究發現，胰島素基因可以促進胰島β細胞產生，當胰島素基因發生高甲基化時，其功能被抑制，使胰島β細胞生成減少，并且發生胰島素抵抗，導致1型糖尿病的發生。

1.2.2.2DNA高甲基化在特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)中的作用 ITP是由多種因素引起的以血小板減少伴或不伴有皮膚黏膜出血為特點的自身免疫性疾病。研究表明，DNA高甲基化參與了ITP的發病[20]。Chen等[21]研究發現，ITP患者中甲基CpG結合域蛋白(methyl-CpG-binding domain，MBD)2和MBD4均降低，而DNA甲基化水平升高，進一步表明DNA高甲基化與ITP的發病相關。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的主要作用是引起細胞凋亡、抗腫瘤。當TRAIL基因啟動子處于高甲基化狀態時，其生成減少，Yang等[22]研究表明，ITP患者巨核細胞膜、血漿中的TRAIL顯著減少，巨核細胞凋亡和血小板釋放也顯著減少。由此推測，TRAIL基因啟動子高甲基化導致TRAIL生成減少，從而抑制巨核細胞凋亡，血小板釋放減少，導致ITP的發生。

1.2.2.3DNA高甲基化在類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)中的作用 RA是一種全身炎癥性自身免疫性疾病，B細胞通過產生高親和力免疫球蛋白G1抗體在關節軟骨表面形成免疫復合物導致關節破壞，而B細胞表觀基因組的特異性高甲基化有助于該抗體的產生，從而在RA發病機制中起重要作用[17]。此外，作為非特異性炎癥性疾病，促炎和抗炎細胞因子參與RA的發生和發展，Fu等[23]通過檢測外周血單核細胞發現，RA患者白細胞介素-10啟動子區域中的近端CpG基序-145C高度甲基化，這可能調節基因轉錄并導致RA的發病。

1.2.3DNA高甲基化在COPD中的作用 COPD是常見的呼吸系統疾病，該病發病率高、致殘率高，嚴重威脅人類健康，吸煙是其主要病因。研究發現，與不吸煙者相比，吸煙者和吸煙相關COPD患者大多數CpG位點(NOS1AP、TNFAIP2、GABRB1、BID、Gabr1等)顯示出顯著的高甲基化，這些基因是COPD發病相關途徑(氧化應激、炎癥反應、線粒體細胞自噬、凋亡等)的一部分[24]。谷胱甘肽是保護氣道上皮免受氧化劑損傷的重要抗氧化劑，其合成受谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)控制。研究表明，小鼠和人類吸煙暴露后，肺上皮細胞膜、血漿和肝臟中谷胱甘肽水平迅速下降[25-27]。Cheng等[28]發現，GCLC啟動子高甲基化導致肺組織中該基因表達降低，血中谷胱甘肽濃度降低，對體內氧化劑-抗氧化劑平衡產生直接影響，因此，吸煙相關的GCLC啟動子區域高甲基化可能是COPD患者發病機制之一。BID蛋白是細胞死亡調節劑BCL-2家族的成員，BID在線粒體中作用于有絲分裂阻滯期，導致細胞凋亡，并參與活性氧依賴的局部線粒體間增強機制，該機制增強了凋亡信號[29-30]。BID基因在吸煙者和COPD患者中均顯示出顯著的高甲基化[31]，由此推測，BID的高甲基化直接或間接參與凋亡機制及線粒體功能障礙，從而導致COPD的發生。除了參與COPD的發病機制，也有學者發現，基因的高甲基化與COPD治療的不良反應有關，糖皮質激素是治療COPD患者急性加重期的重要組成部分，COPD急性加重期患者外周血單核細胞中NR3C1(nuclear receptor subfamily 3,group C,member 1)基因的高甲基化引起NR3C1表達降低，增加了糖皮質激素的抵抗，因而患者預后不佳[32-33]。

2 5-氮胞苷對基因高甲基化臨床常見疾病的干預

2.15-氮胞苷的性質及作用機制 5-氮胞苷是在嘧啶環的5位修飾的核糖核苷，于1964年合成[34]。5-氮胞苷最初作為細胞毒劑被開發應用，它是DNA甲基化的強有力抑制劑，并在培養細胞中誘導基因表達和分化。5-氮胞苷的性質不穩定，在堿性溶液中會不可逆分解。體外研究表明，在37 ℃的中性水溶液中，5-氮胞苷的半衰期為7 h，在體內相應時間為41 min，在4 ℃以下，其化學穩定性相對較好，但隨溫度的升高將快速降解[35]。5-氮胞苷的作用機制為通過濃縮核苷轉運蛋白1轉運到細胞中，并轉化為活性三磷酸鹽形式，即通過尿苷胞苷激酶轉化為5-氮胞苷5′-三磷酸，然后被胞苷脫氨酶(cytidine deaminase，CDA)降解[36]。5-氮胞苷是一種核糖核苷，它被摻入核糖核酸，并在較小程度上摻入脫氧核糖核苷，因而在細胞靜息狀態和分裂狀態時均有作用；摻入的5-氮胞苷在修飾嘧啶的5位通過氮而不是碳破壞DNA和DNMT的共價結合，阻止復合物分解，促進蛋白體降解，并保持與DNA及其DNMT的共價結合，使其功能被阻斷；此外，共價蛋白質結合還損害DNA的功能，并觸發DNA損傷信號，導致被捕獲的DNA降解[8,35-36]。因此，胞嘧啶殘基的進一步甲基化被抑制，導致復制后子細胞中胞嘧啶甲基化的被動損失。在人類中，5-氮胞苷通過CDA代謝，CDA通過將這些藥物轉化為5-氮雜尿苷化合物而使其失活，人體肝臟和脾臟中高水平的CDA是造成體內藥物比體外半衰期短的主要原因[36]。因此，CDA活性的增加可能通過降低藥物濃度和縮短半衰期來降低功效。

2.25-氮胞苷對基因高甲基化臨床常見疾病干預的基礎研究

2.2.15-氮胞苷與腫瘤治療 由于腫瘤抑制基因的高甲基化和DNMT的過度表達已經被確定為致癌的關鍵因素，因此，去甲基化劑似乎特別有希望作為抗癌藥物。通過使用DNMT抑制劑可以實現異常沉默基因的重新表達和正常功能的恢復，DNMT抑制劑5-氮胞苷摻入生長的DNA鏈中并共價結合DNMT，從而調節DNMT信使RNA和蛋白質水平，阻遏DNMT酶活性，導致基因變化激活，通過去甲基化作用有效地抑制腫瘤細胞的生長和增殖，降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，阻滯腫瘤細胞的生長周期，促進腫瘤細胞凋亡，最終抑制腫瘤的發生和發展[37-38]。

2.2.1.15-氮胞苷與血液系統腫瘤的治療 在過去十多年中，骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病的臨床試驗采用了低劑量的5-氮胞苷治療方案，這些方案允許有效的DNA摻入，毒性最小，并顯示出明顯的臨床益處，是唯一被美國食品藥品管理局批準用于治療骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病的藥物，并且5-氮胞苷還被美國食品藥品管理局和歐洲藥品管理局批準用于治療慢性粒單核細胞白血病[39]。目前在部分血液系統疾病治療中的應用已相對成熟。

2.2.1.25-氮胞苷與肺癌的治療 肺癌是世界上最常見的癌癥之一，也是癌癥相關死亡的主要原因。包括腫瘤抑制基因RASSF1A、Keap1(kelch-like ECH associating protein 1)、囊性纖維化跨膜傳達調節因子、Ⅰ型膠原α1啟動子、上皮鈣黏素在內的許多基因的高甲基化與肺癌的發生與進展相關[31，40]；此外，相關研究表明，去甲基化劑能逆轉相關基因的高甲基化狀態，能夠在一定程度上抑制癌細胞的生長[41-42]。FBP1(fructose-1,6-bisphosphatase 1)是糖原異生中的限速酶，由于啟動子DNA序列中的高甲基化，通常在非小細胞肺癌中大量丟失，導致非小細胞肺癌患者的總體存活率降低，其甲基化率與非小細胞肺癌患者的總生存率呈負相關[43-44]。Dong等[45]發現，5-氮胞苷用于人肺癌細胞系A549細胞后可使FBP1基因啟動子去甲基化，提高其信使RNA和蛋白的表達水平，從而在肺癌的發生、侵襲和轉移中起重要作用，為非小細胞肺癌的靶向治療提供了新思路。

2.2.1.35-氮胞苷與食管癌的治療 Li等[46]用50 μmol/L的5-氮胞苷處理EC9706食管癌細胞后發現，SOX17和上皮鈣黏素啟動子的甲基化水平降低，蛋白表達水平增高，使EC9706細胞的增殖和侵襲受到明顯抑制，表明5-氮胞苷通過發揮對SOX17和上皮鈣黏素啟動子的低甲基化作用，抑制EC9706食管癌細胞的增殖和轉移，提示5-氮胞苷可有效治療食管癌。

2.2.1.45-氮胞苷與其他腫瘤的治療 Shao等[47]發現，5-氮胞苷誘導的賴氨酰氧化酶樣4上調可重新激活野生型p53，并引發細胞死亡，從而阻斷肝癌的發展。乳腺癌是一種影響全球女性健康的致命疾病，研究發現，單胺氧化酶水平的降低促進了缺氧環境中乳腺癌模型的腫瘤血管生成和侵襲，而5-氮胞苷通過降低單胺氧化酶甲基化水平促進其表達，能顯著抑制乳腺癌細胞的遷移[48]。Gailhouste等[5]證實，5-氮胞苷在胰腺導管癌細胞系PANC-1中顯示出抗癌作用，對于實體瘤的治療具有潛在吸引力。

2.2.25-氮胞苷與RA的基礎應用 RA是一種全身炎癥性自身免疫性疾病，主要導致關節破壞。RA的發病機制為：B細胞表觀基因組的特異性高甲基化產生高親和力免疫球蛋白G1抗體，在關節軟骨表面形成免疫復合物導致關節破壞，而5-氮胞苷能降低B細胞中相關啟動子基因甲基化，從而抑制自身抗體生成[17,49]。Tóth等[17]以小鼠模型證實，低劑量5-氮胞苷(10 μmol/L)體內給藥能有效治療自身免疫性關節炎，有望替代或與常規關節炎療法組合使用以實現更有效的關節炎管理。

2.2.35-氮胞苷與COPD的治療 雖然COPD的常規治療已越發成熟，在一定程度上能改善患者癥狀，提高生活質量，但目前仍沒有較好的方法使患者獲得臨床治愈。已知DNA高甲基化可能參與COPD的發病機制，并與COPD的易感性和持續性顯著相關，有學者以吸煙小鼠肺氣腫模型證實，DNMT抑制劑有助于臨床治療肺氣腫[50]。而Zhang等[51]通過慢性非炎性二氧化氮肺氣腫大鼠模型發現，5-氮胞苷通過減少肺泡隔細胞凋亡改善肺功能，降低血紅蛋白濃度，改善缺氧癥狀，并輕微增強免疫功能，有望成為新一代靶向治療藥物。

3 小 結

隨著表觀遺傳學的深入研究，越來越多的疾病從基因著手進行靶向治療，且不斷從中獲益。DNA高甲基化已被證實與許多疾病的發生、發展相關，而5-氮胞苷降低總體DNA甲基化的能力已在多個臨床試驗中被驗證。作為強有力的DNA甲基化抑制劑，5-氮胞苷及其衍生物已部分應用于臨床，作為單一試劑或與其他抗癌治療組合，由于在不同細胞中的不同效應，5-氮胞苷有望成為基因靶向治療藥物。雖然大量動物模型研究支持5-氮胞苷的治療效果，但仍需進一步的臨床研究為未來的治療提供有力證據。