肝纖維化治療靶標研究進展

徐詩雨，郭惠婕，劉揭，姜文姣，郝琨

(中國藥科大學藥物科學研究院藥物代謝動力學重點實驗室，南京 210009)

大部分慢性重癥肝病與纖維化相關，且肝纖維化可能進展為肝硬化，若不加以預防，可能會導致肝癌和肝功能衰竭。肝纖維化由各種因素導致的慢性肝損傷引起，如飲酒、病毒、自身免疫和膽汁淤積等，這些因素對肝臟的共同作用是產生導致切口愈合反應異常的慢性炎癥。炎癥可通過引發一系列炎癥反應和釋放多種炎癥細胞因子刺激慢性肝損傷向肝纖維化轉變[1]。目前認為肝星狀細胞的活化是肝纖維化的核心事件，活化的肝星狀細胞可進一步轉化為肌成纖維細胞，該細胞與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的形成有直接關系[2]。除肝星狀細胞外，許多研究者也重視ECM對肝纖維化的直接影響。肝臟中纖維化反應的產生導致ECM合成增多，而降解減少，兩者失去動態平衡，使得ECM過度積累，導致纖維性瘢痕形成，該過程受相關酶的調節[3]。雖然肝纖維化在進入肝硬化之前有逆轉的可能，但迄今為止臨床尚缺乏特異性有效逆轉或阻止肝纖維化進展的藥物，因此尋找肝纖維化治療靶點具有重要意義。現就肝纖維化治療靶標研究進展予以綜述。

1 肝纖維化的發生機制

肝纖維化即肝臟內瘢痕組織，主要由ECM過度積累引起。肝纖維化是眾多慢性重癥肝病發展的共同病理基礎，是肝硬化的早期和必經階段。在體內外炎癥、自由基、膽汁酸、毒素、病毒等危險因素的持續重復刺激下，肝臟內庫普弗細胞、單核細胞、膽管上皮細胞、血管內皮細胞等非肝臟實質細胞，分泌促纖維化細胞因子、生長因子和其他活化纖維化下游效應物等致纖維化物質進入細胞間液，進而激活肝星形細胞發生表型及功能改變，轉變為肌成纖維細胞并不斷增殖，肌成纖維細胞通過旁分泌及自分泌機制合成大量膠原和蛋白多糖等ECM大量蓄積在肝臟細胞間液中形成瘢痕，最終形成肝纖維化[4-7]。

慢性肝臟炎癥的持續刺激是進行性肝纖維化和肝硬化發展的初級生物學標志。肝臟具有獨特的解剖結構，其通過門靜脈和膽管與腸道相連，故腸道菌群產物可以直接輸送至肝臟[8]。這意味著在肝損傷或腸黏膜破裂的情況下，具有免疫調節活性的有毒物質(如脂多糖)可以滲透至肝臟并激活巨噬細胞。而巨噬細胞激活能促進腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1α/β、IL-6、IL-18、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等多種炎癥細胞因子的表達和分泌。隨后，這些炎癥因子激發肝非實質細胞釋放致纖維化物質，致纖維化物質啟動中下游肝纖維化程序，使肝星狀細胞轉變成肌成纖維細胞，并越來越多地表達大量ECM成分。

研究者認為，在纖維化發生過程中，肝星狀細胞的活化具有重要地位[7]。肝星狀細胞有兩種不同的表型，正常肝臟中為靜息狀態，病變時則為活化狀態。促進肝星狀細胞活化的致纖維化物質有纖維化細胞因子、生長因子、轉化生長因子和血小板衍生生長因子等。在正常肝臟中，肝星狀細胞是儲存維生素A的主要細胞。然而在各種因素的刺激下，靜止的肝星狀細胞釋放維生素A，細胞本身的表型和功能均發生改變，使得肝星狀細胞具有移動性、收縮性、化學趨化性，并進一步轉變成病理活化狀態下的肌纖維細胞，繼而引起ECM種類及數量的增加[9]。目前認為，肝星狀細胞活化形成肌成纖維細胞是ECM最重要的細胞來源。

肝纖維化過程的最終環節是ECM過度堆積。誘發肝纖維化的ECM由膠原蛋白、糖胺聚糖、層粘連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖組成[10]。其中，膠原蛋白是ECM的主要成分，其作為完整的超分子結構為纖維化瘢痕組織提供結構框架。在肝纖維發生初期，ECM形成纖維的速度遠大于ECM的溶解速度，使得ECM纖維發生占據主導地位，導致過量ECM沉積纖維形成。在這一病理過程中，同時還伴隨著基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的分泌減少和自身活性的下降，以及金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)的增加，從而導致ECM難以溶解[11]。其中，MMPs主要來源于靜止的肝星狀細胞、肌成纖維細胞及庫普弗細胞等[12]。而TIMP-1是肝臟中MMPs的主要生理抑制劑，金屬蛋白酶生理抑制劑的失調也可以促進肝臟纖維化反應加重，纖維蛋白合成和纖維蛋白溶解穩態的破壞導致功能缺陷的瘢痕組織不斷被單向填充，最終導致肝纖維化。

2 肝纖維化逆轉

從病因治療法的角度來看，炎癥、自由基、膽汁酸、毒素、病毒等刺激因素是主要病因，是可以被干預的環節。減少不利營養因素和環境因素，如高脂食物、酒精、藥物濫用等有助于減輕纖維化進展[13]。對于病毒，如慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者，采用有效的抗病毒療法可以防止肝纖維化惡化，甚至會使其發生逆轉[14]。目前，常用的抗病毒藥物有干擾素、利巴韋林、拉米夫定及胸腺肽等[15-17]。此外，對于膽汁淤積型肝纖維化，熊去氧膽酸治療有一定效果[18]。然而，病因治療法逆轉的肝纖維化改善程度較淺，僅適用于初期肝纖維化患者，對于程度較重的肝纖維化現象難以實現肝纖維化逆轉。

肝損傷早期，庫普弗細胞、單核細胞等分泌轉化生長因子-β，引起肝星狀細胞激活。而轉化生長因子-β主要通過細胞內的Smad通路介導肝星狀細胞的生物學活性[19]。因此，可以通過免疫抑制劑霉酚酸酯和雷帕霉素阻斷Smad通路來抑制肝纖維化進程[20]。此外，單核細胞和巨噬細胞產生的腫瘤壞死因子-α具有促炎及細胞毒性作用，它不僅能直接刺激肝星狀細胞的增殖，還能與IL-1、IL-6共同通過肝炎癥反應間接刺激肝星狀細胞的活化[21]。有研究者在肝癌細胞株Huh7細胞上，用腫瘤壞死因子-α抑制劑 Lenalidomide成功抑制了丙型肝炎病毒的感染及后續纖維化[22]。

抑制肝星狀細胞向肌成纖維細胞活化，減少ECM是肝纖維化形成的終末環節。此過程一方面可使活化的肝星狀細胞失活，從而阻止其分化為肌成纖維細胞；另一方面為細胞啟動凋亡信號，即啟動肌成纖維細胞凋亡程序。在肝臟的生理穩態環境下，正常的肝臟組織需降解多余的膠原、糖胺聚糖、層粘連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等ECM成分。該過程涉及的主要降解物質為MMPs，它是一種鋅和鈣依賴性蛋白水解酶，可由多種細胞產生，主要作用為降解ECM的膠原蛋白。因此，MMPs的活化在肝纖維化消退過程中必不可少。

3 肝纖維化消退的潛在靶標

3.1靶向炎癥介質 在肝纖維化中，ECM的炎癥微環境提供了諸多的潛在藥物靶標。其中，代表性的炎癥靶標為骨橋蛋白-1，又稱骨涎蛋白-1，其由約300個氨基酸組成，在肝臟中具有廣泛的生物活性。它在纖維化組織中高度上調，并影響了人和小鼠肝臟中產生致纖維化物質的諸多細胞的功能[23]。根據這一病理基礎，治療實體與中和受體均適合作用于骨橋蛋白，進而調節細胞功能并減少肝纖維化的發生。

IL-12是一種異源二聚體細胞因子，其主要由樹突狀細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞以及一些抗原呈遞細胞產生。腫瘤壞死因子-α能促進分化的CD4+T輔助細胞增殖，誘導自然殺傷細胞和T細胞產生細胞因子(主要成分為γ干擾素)，繼而發生抗炎反應和免疫反應。所以，IL-12可以通過抗炎反應，間接抑制肝纖維化的發生。同時，γ干擾素又能促進抗原呈遞細胞再次分化和增殖，使IL-12大量分泌，形成一個強大的反饋環[24]。可見，IL-12在細胞炎癥反應、免疫系統調節和肝臟纖維化逆轉中扮演重要角色，可以通過增加肝內IL-12的表達來減緩肝纖維化的發生。在IL-12的抗腫瘤治療中，有實驗利用新型EB病毒作為載體，將IL-12靶向導入不同的肝癌細胞株內，并檢測IL-12的活性[25]。該新型EB病毒攜帶人甲胎蛋白基因的啟動子和增強子。逆轉錄聚合酶鏈反應檢測結果顯示，產生人甲胎蛋白基因的肝臟腫瘤細胞中有IL-12信使RNA的轉錄[25]。隨后的活性檢測證明，肝癌細胞中表達的IL-12有誘導γ干擾素產生生物學活性的功能[25]。腫瘤局部高濃度的IL-12可以促進細胞毒性T淋巴細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞和自然殺傷細胞等在腫瘤部位大量浸潤并增強它們的抗腫瘤功能，增強輔助T細胞-1介導的細胞免疫反應，最大限度地減少全身應用IL-12所產生的副作用，并最大限度地發揮IL-12的抗腫瘤作用。因此，可以借鑒EB病毒pEBAF運載IL-12靶向作用腫瘤細胞的機制，通過轉基因工程介導IL-12產生靶向肝纖維化組織的作用，減緩甚至逆轉肝硬化和肝纖維化進程。

3.2靶向抑制肝星狀細胞活化 肝纖維化中過剩的ECM被MMPs降解，MMPs主要由靜止的肝星狀細胞產生，而大量激活的肝星狀細胞阻礙了MMPs的產生，間接促進了肝纖維化。可見，活化的肝星狀細胞失活或減少是肝纖維化消退的關鍵。

在肝纖維化進程中，活化的肝星狀細胞表面存在甘露糖-6-磷酸酯受體高度表達，該受體對甘露糖-6-磷酸修飾的人血清白蛋白(mannose-6-phosphate-human serum albumin，M6P-HSA)具有高親和力。因此，M6P-HSA可以作為抗肝纖維化藥物(己酮可可堿、甘草次酸等)的載體，其與肝細胞表面的甘露糖-6-磷酸酯受體相結合，從而讓肝纖維化治療藥物被選擇性地投放到肝星狀細胞表面，最終達到靶向抗肝纖維化的目的[26]。有試驗表明，將腎素-血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1受體)拮抗劑與M6P-HSA結合形成M6P-HSA-AT1受體拮抗劑，可以達到抗肝纖維化的目的[27]。因為在腎素-血管緊張素系統中，血管緊張素Ⅱ可通過刺激AT1受體直接活化肝星狀細胞，引起ECM大量堆積，最終導致肝纖維化。因此，可以將M6P-HSA-AT1受體拮抗劑靶向作用于肝星狀細胞表面，通過阻斷肝星狀細胞AT1受體，減少肝星狀細胞中細胞間黏附分子-1和IL-8的表達，從而減緩肝星狀細胞的活化，最終實現肝纖維化治療[27]。目前，最常用的AT1受體拮抗劑為氯沙坦。有研究者用膽管結扎或四氯化碳所致的大鼠晚期肝纖維化模型評價該藥的短期抗肝纖維化作用，結果顯示，空白對照組、給藥組的原膠原α2(Ⅰ)基因表達顯著減少，表明其抗纖維化作用顯著[27]。隨后的組織分布實驗結果顯示，肺、脾、心肌、腎組織中均檢測不到氯沙坦-M6P-HSA，只有肝非實質細胞中能夠檢測到[27]，提示氯沙坦是良好的靶向抗纖維化藥物。

3.3靶向促進ECM降解和抑制膠原蛋白合成 ECM合成和降解由MMPs調控，而MMPs的活動由TIMPs調節。其中，肝星狀細胞表達的TIMPs的主要成分為TIMP-1和TIMP-2[28]。有證據表明，在肝星狀細胞活化期間及實驗性肝纖維化進程中，幾種常見MMPs的酶活性降低，產生這種現象的原因為TIMP-1的表達增加，阻礙了膠原蛋白的降解[12]。在人纖維化肝臟中，TIMP-1和TIMP-2的表達較正常肝臟高5倍[29]。由此可知，TIMPs表達的增加，ECM的合成和降解失調，使ECM往合成增加的方向發展，繼而引起組織纖維化。

基于上述治療靶標，Cong等[30]提出了構建以重組腺相關病毒為載體靶向作用于大鼠TIMP-1的小干擾RNA(recombinant Adeno-associated virus/small interfering RNA-tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1，rAAV/siRNA-TIMP-1)，并進一步證實了rAAV/siRNA-TIMP-1在大鼠肝纖維化模型中的作用。有學者對四氯化碳和膽管結扎兩種大鼠肝纖維化模型給予rAAV/siRNA-TIMP-1治療發現，肝膠原積累量、羥脯氨酸含量和肝臟及血清中Ⅰ型和Ⅲ型膠原濃度均降低[30]。此外，活化肝星狀細胞的生物標志物α-平滑肌肌動蛋白和轉化生長因子-β1(對肝纖維化的發展至關重要)的表達顯著減少。可見，使用rAAV/siRNA-TIMP-1治療顯著減緩了四氯化碳和膽管結扎誘導大鼠的肝纖維化進程。有數據表明，rAAV/siRNA-TIMP-1是通過直接抑制TIMP-1的表達及增加MMP-13的活化來使ECM降解增多、合成減少，最終減輕肝纖維化[30]。可見，rAAV/siRNA-TIMP-1可能是一種有效的抗纖維化基因治療劑。

此外，還可以通過抑制膠原蛋白的合成減少ECM，從而逆轉肝纖維化。膠原蛋白是纖維化中ECM的主要成分，占肝硬化肝臟干重的50%[31]。來自中央結構的Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型膠原蛋白合成纖維絲，其他膠原蛋白、非膠原膠質蛋白和蛋白多糖直接或間接黏附于該合成纖維絲上形成各種ECM組件。目前，廣泛使用的抑制Ⅰ型膠原蛋白(最豐富的瘢痕膠原蛋白)合成的方法存在一定危險，且無顯著的抗纖維化作用，因為這種抑制可能導致器官功能障礙并有利于癌癥生長。但通過使用優化的抗原膠原α1(Ⅰ)小干擾RNA脂質復合物，可以在體內實現特異性抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成。這些脂質復合物的腸外應用導致毒素誘導和膽汁性肝纖維化小鼠模型中原膠原α1(Ⅰ)合成的減少大于90%，且當晚期肝纖維化開始治療時，肝臟中總膠原蛋白的積累減少高達50%[32]。故推測，原膠原α1(Ⅰ)為肝纖維化的有效靶點。這在四氯化碳誘導的被敲除原膠原α1(Ⅰ)基因的小鼠中得到證實[33]。研究顯示，載有抗原膠原α1(Ⅰ)小干擾RNA的脂質體復合物幾乎完全由肝臟吸收，并在ECM中集中[32]。同時，使用抗原膠原α1(Ⅰ)小干擾RNA納米水凝膠粒子復合物也得到類似結果[34-35]。

4 小 結

肝纖維化主要由炎癥介質誘導肝星狀細胞活化為肌成纖維細胞，導致ECM過量堆積形成。同時，通過對肝纖維化的分子機制的深入分析，可以發現逆轉肝纖維化發生的環節和靶標，即靶向抑制炎癥介質、肝星狀細胞和TIMPs。但是，這些干預環節和靶標研究結果大多處于前瞻性研究階段，故仍需要與人源性發病機制相結合，才能研發出療效確切安全性高的抗肝纖維化藥物制劑。目前用于治療肝纖維化的藥物已經取得了很大進展，有些已進入臨床階段，但是在晚期纖維化難以治療的情況下，迫切需要探索載體技術改善肝纖維化的治療策略。