蛋白親環素D基因功能研究進展

胡威，祝恒成，李浩勇，劉修恒，曾艷

(武漢大學人民醫院泌尿外科，武漢 430060)

蛋白親環素D(cyclophilin D，CypD)是由順-反異構酶F基因編碼的線粒體基質蛋白，為一種肽基脯氨酰異構酶和可溶性蛋白，是線粒體親環蛋白基因家族的成員[1]，CypD由兩層膜包被，直徑 0.5～1.0 μm，為紡錘狀或棒狀，需使用電子顯微鏡識別。線粒體是細胞中制造能量的結構，同時是細胞進行有氧呼吸的主要場所，被稱為細胞的發動機，與細胞內鈣離子(Ca2+)平衡相關。關于線粒體早期的研究主要涉及細胞凋亡，線粒體內膜外側的外周蛋白細胞色素C能介導細胞凋亡，而細胞色素C為可溶性蛋白，易于獲得結晶，且研究方法較簡單方便，因此細胞色素C是目前研究較透徹的凋亡基因。隨著研究的深入，人們發現線粒體與“壞死”——細胞死亡的另外一種途徑密不可分，其中涉及線粒體的另一個重要結構，即線粒體通透性轉化孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，而CypD是MPTP的調控開關[2]。CypD結合于MPTP的腺苷酸轉位子上，是一種肽基脯氨酰異構酶，定位于10q22～10q23，信使RNA全長2 213個堿基，編碼207個氨基酸[3]。目前國內外關于CypD功能的研究已開展20余年，對CypD的功能已有了比較詳細和全面的認識，現就CypD基因功能的研究進展予以綜述。

1 CypD與缺血再灌注損傷

早在2005年，兩個獨立的研究小組使用當時最先進的基因敲除技術，將實驗小鼠的CypD基因敲除，得到的CypD基因敲除小鼠對心臟的缺血再灌注損傷有顯著的抵抗作用，且得到的CypD基因敲除小鼠未表現其他生理和病理異常，該研究成果發表于同年3月的《Nature》雜志，并得到了線粒體研究領域權威專家Halestrap教授的認可；同時，研究人員從CypD基因敲除小鼠的心、肝、腦等重要器官中分離出線粒體，電子顯微鏡下發現這些線粒體在形態上完全無異常表現，但對過量Ca2+導致的線粒體腫脹和通透性轉換具有了抵抗作用[4-5]。此后，有研究表明，CypD基因敲除對缺氧誘導的正常大鼠腎細胞壞死途徑的細胞死亡有抵抗作用；此外，通過慢病毒載體等分子生物學技術下調CypD的表達對大鼠腎缺血再灌注損傷具有保護作用[6-7]。而下調CypD的表達在心、腦、肺等重要器官缺血再灌注損傷中的保護作用也得到了驗證，2005年前的研究提示，CypD可能是通過調節腺苷酸轉位子的功能，抑制細胞凋亡，從而發揮作用[4-5，7-12]，即細胞凋亡→細胞死亡通路；2005年后，關于CypD基因的作用機制逐漸清晰起來，CypD的過表達能直接促進線粒體MPTP的開放，從而導致線粒體通透性的轉變，線粒體的通透性增加后，細胞對外界刺激誘導細胞壞死的敏感性將增加，常見的外界刺激有一氧化氮和一些化療藥物等[6，13-20]。而常用的凋亡誘導劑羰基氰化物間氯苯腙在該過程中卻沒有任何作用，甚至還產生了抑制，說明細胞壞死過程與CypD誘導的線粒體通透性改變有密切關系[17-20]。此外，雖然CypD基因敲除的小鼠在發育上無異常，但體外實驗表明，正常小鼠和CypD基因敲除小鼠的CypD基因在細胞水平的差異有統計學意義；且由于CypD基因已被敲除，環孢菌素A(cyclosporin A，CsA)對CypD基因敲除小鼠無效[21-23]。但卻對活性氧類及Ca2+超載誘導的細胞壞死產生了抵抗，細胞壞死過程受到抑制后減慢，而細胞凋亡的過程卻無異常變化[24-27]。

此外，動物實驗發現，CypD基因敲除小鼠能抵抗缺血再灌注誘導的心肌損傷，減少心肌壞死；反過來，用慢病毒過表達載體將轉基因小鼠的CypD基因過表達，實驗動物則會出現心肌肥大并伴有心肌細胞功能下降，體外實驗觀察到心肌細胞壞死增加，并伴有線粒體的異常腫脹[9]。在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中，通過小干擾RNA或慢病毒載體下調CypD基因表達能對大鼠腎缺血再灌注損傷產生抵抗[6]。結合以上這些數據得出結論：CypD誘導的線粒體通透性轉變不再單純的是細胞色素C通路介導的細胞凋亡，還介導了一種調節性壞死，即Ca2+超載和氧化損傷等外界因素誘導的細胞壞死[28-29]。

2 CypD與氧化應激

氧化應激的定義是指體內氧化與抗氧化兩者失衡，氧化強于抗氧化，機體傾向于被氧化，體內高活性分子(如活性氮自由基與活性氧自由基)產生過多，氧化程度超出了氧化物的清除速度，從而導致組織損傷[30-31]。近年來，研究人員對抗氧化治療的研究取得新進展，提出了“氧化應激干擾”的新觀點[32]。氧化應激干擾是指機體在健康或亞健康狀態時，體內老化的舊細胞及已發生變異的細胞(如腫瘤細胞)通過氧化應激被清除掉，并排出體外，這樣機體的內環境才能保持平衡，并維持在一種有序、健康的狀態，此時氧化應激的作用是積極、正面的，相當于機體的自我修復過程[33-34]。也可以這樣講，氧化應激是一種生物體的自我保護及自我更新的有效手段，這是生物體經過長期發展、進化及自然選擇所獲得的。

但是，如果生物體內的這種正常秩序被一種或多種原因破壞，比如，當外源物(如細菌、病毒等微生物)侵入時，生物體的第一反應往往是啟動異源物代謝，此時產生大量的活性氧自由基，氧化應激隨即啟動，將侵入的微生物過氧化，從而殺死并清除這些外源物[35]。此過程一般都會使機體產生過量的活性氧類及其副產物，暫時處于窗口期，如外源物過多，超出氧化應激清除能力，就會產生過量的活性氧類，過量的活性氧類對機體有害，它會產生大量變性蛋白質及脂質等，會造成循環異常，并同時誘導代謝，甚至改變基因表達，造成機體相關功能異常，導致機體內處于進一步無序的狀態[36]。

當生物體氧化劑和抗氧化劑不平衡時，氧化應激水平會大幅升高，在窗口期內，僅處于量變階段，不會造成器質性的病變，生物體也不會有任何異常表現，即“亞健康”狀態，當氧化和氧化劑繼續失衡，超出了氧化應激窗口期后，生物體將會出現器質性病變[33-36]，即病理狀態。研究表明，氧化應激窗口期依然涉及Ca2+內穩態及線粒體通透性轉化等關鍵步驟，CypD基因作為線粒體MPTP的開關及線粒體的重要組成部分起著重要作用，在體外實驗中，隨著氧化應激強度的增加或作用時間延長，正常人類腎小管上皮細胞壞死明顯增加[36]。應用小干擾RNA直接下調細胞CypD基因的表達，或使用CypD抑制劑CsA均能有效減少氧化應激對正常人腎小管上皮細胞的損傷，而氧化應激誘發人腎小管上皮細胞的壞死過程依賴于CypD[28-29，35]。此外，研究人員發現，缺血組織發生再灌注時，組織同時也會產生大量的過氧化氫，過量的過氧化氫反過來會介導氧化應激，導致細胞損傷及死亡，將組織損傷的過程加速，這說明缺血再灌注損傷和氧化應激兩者之間有著某種聯系，可以相互促進，導致組織損傷加重，細胞迅速壞死[26，29]。但CypD在氧化應激窗口期發揮的作用，具體機制目前并未完全研究清楚，它具體是僅通過線粒體途徑調控細胞壞死來發揮作用，還是直接通過抗氧化來逆轉組織的過氧化狀態，或是以上兩種作用兼而有之，還需進一步研究證實[36]。

3 CypD與腫瘤的關系

關于CypD基因功能的研究，早期僅局限于缺血再灌注損傷及氧化應激等生理過程，僅認為CypD主要通過調節MPTP通透性或腺苷酸轉位子的功能來發揮調節細胞壞死或細胞凋亡的作用[19，21]。隨著對CypD基因功能研究的深入，CypD與腫瘤的關系逐漸成為最近5年研究的熱點，但并未發現小鼠器官出現腫瘤改變，僅為心肌細胞中的線粒體的異常膨脹[37-38]。進一步研究表明，CypD基因的表達在人類腎癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、乳腺癌細胞中均出現了特異性的改變，主要機制目前有如下幾種解釋：①從分子生物學角度理解，腫瘤本質是細胞的過度增殖，早期研究表明，CypD可通過下調細胞凋亡而促使腫瘤的發生，主要還是通過調控MPTP的開放，通過調節Ca2+通道介導的激活來調節凋亡，此過程中細胞器內相關的離子平衡會打破，導致細胞器腫脹，進而導致細胞外膜破裂和線粒體釋放促凋亡因子，從而控制細胞死亡過程，導致細胞過度增殖，導致腫瘤發生發展，在整個過程中CypD調節MPTP的開放是一個重要的步驟[5-6]。②隨著研究的繼續深入，研究人員發現，CypD導致線粒體功能改變時，將協同刺激產生活性氧自由基，并激活c-Jun 氨基端激酶信號轉導通路，而c-Jun氨基端激酶能配合致癌基因Ras抑制 Hippo信號轉導通路，導致致癌基因上調，促進腫瘤的發展[37-38]。另外，有研究者發現了一個新的介導腫瘤細胞死亡的機制(不同于通過單純的調節CypD的表達導致MPTP開放)，即某些基因(如哺乳動物不育系20樣激酶1)可通過與CypD結合形成大分子蛋白復合物直接改變MPTP的結構，研究人員用化療藥物吉西他濱刺激哺乳動物不育系20樣激酶1基因，哺乳動物不育系20樣激酶1與CypD組成的大蛋白復合物在線粒體上被檢測到；同時，使用CypD抑制劑CsA阻止大蛋白復合物的形成，可以抑制吉西他濱誘導的細胞死亡，表明CypD基因可能決定吉西他濱的耐藥[38-39]。③還有研究表明了CypD是同時通過下調細胞凋亡和調節細胞壞死兩組途徑來促使腫瘤發生的，且主要是通過胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號通路來發揮作用[40-46]。CypD誘導的腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)組織細胞壞死和凋亡均過度表達，CypD蛋白的下調抑制了腎癌細胞的凋亡及壞死，促進了細胞周期蛋白的發展，導致細胞過度增殖[44]。基于CypD對MPTP開放的調控作用，CypD過表達誘導線粒體膜電位去極化。提示CypD表達下調抑制了MPTP的開放，促進了ccRCC的發展。

來自人類ccRCC組織標本的主要免疫組織化學數據顯示，與癌旁組織相比，ccRCC中的CypD蛋白表達顯著降低，并且觀察到CypD表達與腫瘤分期、大小及淋巴結轉移之間的相關性，表明CypD表達與ccRCC的發展呈負相關[44]。細胞系中CypD的表達也下調。研究表明，索拉非尼(治療轉移性ccRCC的二線藥物)能上調腎癌細胞中CypD的表達，同時對體外培養的ccRCC細胞株具有抑制增殖、誘導凋亡和線粒體膜電位去極化的作用[44]。CypD抑制劑(CsA)和小干擾RNA-CypD逆轉了索拉非尼對ccRCC細胞增殖、凋亡和線粒體膜電位去極化的影響，表明索拉非尼的抗腫瘤作用與CypD通過線粒體途徑誘導細胞凋亡有關[44-45]。來自CypD組織的主要免疫組織化學數據顯示，與癌旁組織相比，ccRCC中ERK蛋白表達顯著增加，且ERK和CypD的表達呈負相關[44]。體外研究表明，ERK可以負調控CypD的表達，促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2及其下游ERK的去磷酸化介導ccRCC的凋亡[42-45]。這些結論提示，ERK的激活抑制了介導MPTP開放和誘導ccRCC凋亡的CypD的表達，同時pcDNA3.1-ERK (ERK激活物)的過度表達能抑制索拉非尼對CypD表達的刺激作用，從而誘導腎癌細胞凋亡和線粒體膜電位去極化[46-49]。這些結果表明，CypD是通過ERK信號通路途徑介導索拉非尼對抗ccRCC的作用，同時也支持CypD是索拉非尼的一個抗癌藥物靶點[44-49]。

4 小 結

CypD是細胞器線粒體的重要組成部分，CypD功能的研究大致上經歷了三個階段。第一階段，認為CypD基因主要是通過干擾細胞凋亡介入線粒體途徑的細胞死亡；第二階段，認為CypD主要是通過線粒體途徑的調控性細胞壞死發揮抗氧化應激及器官缺血再灌注損傷等過程，不是簡單的調控細胞凋亡；第三階段：CypD基因功能進一步延伸至多種腫瘤，且CypD基因可通過干擾凋亡及調節性壞死在腫瘤發生發展中發揮作用。同時CypD基因是某些抗癌化療藥物的靶點(吉西他濱、索拉非尼等)。