程序性壞死的信號轉導機制及其在創傷性顱腦損傷中的研究進展

馬強，韓瑞璋，靳華，張廣輝

(陸軍第七十二集團軍醫院神經外科，浙江 湖州 313000)

1859年Virchow[1]第一次提出壞死的概念,并將其定義為快速、偶發且無控制的細胞死亡，其特征為細胞腫脹和細胞膜破裂導致的炎癥反應。1972年，細胞凋亡成為第一個被發現和研究的程序性死亡方式，此后凋亡和不受調控的壞死被認為是細胞死亡的兩種主要形式[2]。然而，壞死的不可調控性受到眾多科學家的質疑。Fukuda等[3]通過研究缺血缺氧受損的海馬神經元細胞，發現了一種既非凋亡也非壞死并受某些信號調節的新型死亡方式。Degterev等[4]將這種受信號調節的新型死亡方式稱為程序性壞死。同時，Teng等[5]發現了一種能夠特異性阻斷由死亡受體信號通路引起的胱天蛋白酶(caspase)非依賴性細胞死亡，并將能被Nec-1(Necrostatin-1)特異性抑制的細胞死亡方式稱為程序性壞死。細胞死亡命名委員會根據細胞死亡的形態學特征將細胞死亡分為凋亡、自噬和程序性壞死[6]。近年來，有效抑制程序性壞死在創傷性顱腦損傷患者救治中的作用成為研究熱點，且Nec-1在顱腦損傷治療中的有效性已得到大量動物研究證實?，F就程序性壞死的信號轉導機制及其在創傷性顱腦損傷中的研究進展予以綜述。

1 程序性死亡方式的區別與聯系

凋亡是受基因嚴格控制的生理性細胞死亡過程，包括外源性和內源性兩種信號轉導通路，均需要caspase的參與。凋亡細胞具有特定的形態學變化，如細胞皺縮變小，與周圍細胞分離，染色質聚集、核固縮、碎裂、凋亡小體的形成，但無細胞膜的破裂和細胞內容物的外溢，所以不會引起炎癥反應，其在維持細胞內環境穩定中起重要作用[7]。凋亡早期發生細胞膜骨架的降解，而細胞器的降解發生在凋亡后期。凋亡的激活需要caspase，也可被caspase抑制劑(凋亡抑制蛋白、細胞因子效應調節劑等)抑制[8]。自噬的特點為自噬體的形成，其是無核糖體區域的粗面內質網脫落，形成雙膜結構包裹的細胞器和細胞質大分子，隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，是實現細胞代謝及更新胞內細胞器的過程[9]。自噬缺乏染色質凝集，細胞質中有大量的自噬空泡形成。細胞器的破壞發生在自噬的早期階段，細胞膜骨架的破壞發生在自噬晚期。自噬的作用主要為降解細胞內的蛋白質和異常的細胞成分，最終也可導致細胞死亡。程序性壞死是由受體相互作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)調節的一種非caspase依賴性死亡方式，RIP1和RIP3的磷酸化及壞死復合體的形成是程序性壞死的重要標志[10-11]。程序性壞死的機制及細胞形態的改變不同于凋亡，但具有壞死經典的形態學特征：細胞腫脹變圓，細胞器腫大，隨后線粒體裂解、溶酶體及細胞膜破裂導致細胞死亡，胞內物質釋放形成顯著的炎癥反應[12]。

有研究表明，細胞凋亡和壞死是細胞死亡的兩種主要方式，而自噬既可支持細胞生存也可促進細胞死亡[13]。雖然細胞凋亡、自噬及程序性壞死均有各自獨特的信號通路和形態學差異，但在某些情況下，3種程序性死亡方式之間存在相互轉化。如某些情況下抑制凋亡可引起自噬，當caspase缺乏時又可引起細胞發生程序性壞死，而Nec-1可以使細胞發生凋亡。其中，自噬可通過減少內源性凋亡抑制物或通過選擇性減少促凋亡蛋白來促進或抑制細胞發生凋亡。自噬與凋亡既可相互促進，又可相互拮抗，主要取決于細胞所處的具體環境，如在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α及氧化等的刺激下，細胞可通過線粒體釋放凋亡誘導因子(細胞色素C及氧自由基等)誘導細胞發生凋亡[14]。然而，凋亡細胞中受損傷的線粒體也可通過細胞的自噬途徑被清除，阻止細胞發生凋亡，從而對細胞起保護作用[15]。

2 程序性壞死的信號轉導機制

2.1程序性壞死的啟動 有很多因素可引起細胞發生程序性壞死，如TNF-α、干擾素、TNF相關凋亡誘導配體、DNA損傷、脂多糖、外傷、強酸、強堿及過氧化氫等，還包括某些細菌、病毒感染和射線等[16]。程序性壞死的啟動主要由一系列受體及其配體相連接而誘導激活，不同的細胞會根據自身所處的微環境及損傷的方式或損傷的程度選擇凋亡途徑或程序性壞死途徑。誘發細胞發生程序性壞死的受體主要有兩類：死亡受體和病原識別受體。其中，病原識別受體主要由一些固有免疫細胞表達，包括固有免疫病原模式識別受體及核苷酸結合寡聚化結構域樣受體等，主要參與某些細菌或病毒入侵而發生的免疫應答反應。而常見的死亡受體包括補體59、腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)1和TNFR2及TNF相關凋亡誘導配體受體等。死亡受體與病原識別受體均包含死亡結構域蛋白，其可與相應配體結合誘導細胞發生程序性壞死[17]。關于程序性壞死的信號轉導機制，目前研究最深入的為TNF-α-TNFR1途徑。

2.2壞死復合體的形成 在外界信號刺激下，TNFR1 被激活，TNF-α與細胞膜上TNFR1的死亡受體結合，促使TNFR1在胞質內形成同源多聚體，并發生構象改變，TNFR1可通過胞內段的死亡結構域與TNF死亡受體相關結構域蛋白結合，RIP1通過 C端的死亡決定簇與活化的TNFR1死亡受體結構域結合形成蛋白復合體，稱復合體Ⅰ，為募集下游一系列的效應蛋白和相關酶的激活提供了良好條件[18]。隨后細胞將復合體Ⅰ內吞，TNF-α從復合體Ⅰ中解離，同時復合體Ⅰ離開細胞膜進入胞質，死亡受體相關死亡結構域蛋白通過招募caspase-8并與之結合形成復合體Ⅱa[19]。復合體Ⅱa形成后，細胞會根據自身所處的微環境及損傷程度等選擇凋亡途徑或程序性壞死途徑。若caspase-8被激活，其可與死亡受體相關死亡結構域蛋白形成同源二聚體，并通過相互切割而活化，進一步激活下游的caspase-3、caspase-6及caspase-7等，此時復合體Ⅰ被裂解，促進細胞發生凋亡；若caspase-8的活性因一系列理化因素被抑制，細胞會發生程序性壞死，此時RIP1發生去泛素化，RIP3被募集并與RIP1通過各自的同型相互作用模體結合形成復合體Ⅱb，成為壞死復合體中的核心部分，并啟動程序性壞死下游的信號轉導通路。

其中，RIPs是一種具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的蛋白質，RIP1和RIP3可通過N端保守的激酶結構域相互磷酸化，使復合體Ⅱb形成壞死復合體，同時進一步激活RIP3并在其199號絲氨酸處發生自身磷酸化，大量活化的RIP3通過一系列信號通路的傳遞，加速細胞程序性壞死的發生[20]。有研究顯示，在RIP3基因敲除小鼠的胚胎成纖維細胞中，RIP1可以正常表達，細胞會發生凋亡，但不會發生程序性壞死[21]；而在有RIP3存在的情況下，細胞發生TNF-α所誘導的程序性壞死，說明RIP1是啟動細胞發生程序性壞死上游的關鍵激酶[22]?？梢?，RIP3是TNF-α誘導細胞發生程序性壞死所必需，同時也是調控程序性壞死的特異性蛋白分子。

2.3程序性壞死的執行 壞死復合體形成后，主要通過3種途徑誘導細胞發生程序性壞死，這3種途徑既相互獨立，又相互交錯，是一個復雜的網絡[23]。

2.3.1活性氧類(reactive oxygen species,ROS)代謝相關途徑 壞死復合體通過中斷親環素和嘌呤核苷酸移位酶之間的相互作用，上調糖原磷酸化酶、谷氨酸脫氫酶及谷氨酰胺合成酶等活性，其中糖原磷酸化酶可促進糖原分解為葡萄糖-1-磷酸，過量產生磷酸化葡萄糖，谷氨酸脫氫酶及谷氨酰胺合成酶使α-酮戊二酸大量合成，加速線粒體內的三羧酸循環過程，使呼吸鏈被過度激活，產生過量的ROS(超氧陰離子、羥自由基及過氧化氫等)并聚集，使細胞發生強烈的氧化應激反應。一方面，ROS可阻斷呼吸鏈，細胞因能量代謝障礙而死亡；另一方面，ROS可引起細胞膜脂質過氧化或改變細胞器膜某些通道蛋白功能，如溶酶體受到ROS的損傷后，溶酶體膜通透性的增加可導致溶酶體酶的大量釋放，誘發細胞自我消化而死亡。崔紅旺等[24]利用TNF-α誘導小鼠骨樣細胞發生程序性壞死，并通過熒光酶標儀檢測發現有大量ROS產生，使用Nec-1后ROS水平明顯降低，發生程序性壞死的細胞數量也相應減少，說明誘導小鼠骨樣細胞發生程序性壞死的可能為ROS。Vanden等[25]研究發現，在TNF-α存在的條件下，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1能明顯促進ROS的生成和活化，促使細胞壞死，但在使用抗氧化劑或敲除細胞中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1后，TNF-α介導的細胞壞死顯著減少。但有學者認為，程序性壞死的發生與ROS并沒有直接聯系[26]。有學者在淋巴瘤細胞的研究中發現，即使將細胞內ROS清除也不能阻止程序性壞死的發生[26]。所以對于當前的研究結果，ROS在程序性壞死過程中的作用機制取決于不同細胞類型和實驗方案。

2.3.2核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)相關途徑 NF-κB是一種廣泛存在的轉錄因子，其參與多種免疫應答。在正常情況下，細胞質中的NF-κB與其抑制劑緊密結合。RIP3的過表達會誘導NF-κB激活，NF-κB與其抑制劑分離成為游離的NF-κB，游離的NF-κB轉入細胞核內誘導促炎細胞因子表達，導致大量炎癥細胞浸潤，促進細胞壞死。另外，大量RIP3的表達對NF-κB激活有正反饋作用，可加速細胞發生程序性壞死的過程。Kasof等[27]通過TNF-α誘導宮頸癌細胞發生程序性壞死，發現RIP3的過表達可增強核因子NF-κB基因的表達，發生程序性壞死的宮頸癌細胞明顯增加。

2.3.3MLKL相關途徑 RIP1與RIP3具有相似的N端激酶結構域及C端同型作用結構域，RIP1/RIP3壞死復合體形成可導致RIP3的進一步聚集與活化，并在其他蛋白的協助下招募RIP3的底物分子混合系激酶區域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)。MLKL的N端具有激酶結構域，但無激酶活性，需通過C端激酶結構域與RIP3相互結合才可被磷酸化與多聚化，并使其從細胞質轉移到細胞膜及細胞器膜，同時MLKL的N端能插入細胞膜結構內并與膜上的脂類物質磷脂酰肌醇磷酸鹽2和5結合，使細胞膜產生通透性孔道，破壞細胞膜的完整性，Na+或Ca2+大量內流入細胞質，細胞內的滲透壓過度升高導致細胞腫脹，最后死亡[28]。研究表明，抑制細胞膜脂類物質磷脂酰肌醇磷酸鹽2和5的形成會明顯抑制程序性壞死，但對細胞凋亡無影響[29]。MLKL基因敲除小鼠及RIP3基因敲除小鼠均具有相似的抗程序性壞死能力，且磷酸化的MLKL信號轉導可以被Nec-1阻斷，但不能被MLKL的功能抑制劑(2E)-N-{4-〔[(3-甲氧基-2-吡嗪基)氨基]磺?；潮交鶀-3-(5-硝基-2-噻吩基)-2-丙烯酰胺阻斷，同時RIP1的信號表達不受MLKL抑制劑的影響，故推測MLKL的作用機制位于RIP1/RIP3下游，且細胞是通過MLKL相關途徑發生程序性壞死。

3 程序性壞死的抑制

程序性壞死可被許多抑制物抑制,如RIP1抑制劑、RIP3抑制劑、MLKL抑制劑等[30]。目前認為，RIP1抑制劑Nec-1是程序性壞死的特異性抑制劑，其可抑制RIP1激酶活性，將RIP1的活性片段處于失活狀態，并阻止RIP3被募集及RIP1與RIP3相互磷酸化，從而減少程序性壞死的發生，這一觀點已在動物模型中得到證實[31]。楊吉平等[32]認為，Nec-1可抑制RIP1的磷酸化，明顯減輕小鼠神經細胞的炎癥反應。崔紅旺和蔣電明[33]研究發現，Nec-1可明顯減少小鼠骨細胞RIP1/RIP3蛋白的表達，并有效抑制小鼠骨細胞的程序性壞死。Degterev等[4]研究發現，Nec-1可顯著降低因缺血缺氧受損的腦神經細胞死亡率，明顯減少神經細胞程序性壞死的發生。

4 程序性壞死與創傷性腦損傷

目前發現，創傷性顱腦損傷可導致神經細胞死亡，包括凋亡、自噬及程序性壞死[30]。其中，程序性壞死廣泛存在于受傷的神經細胞中。在控制性小鼠皮質沖擊損傷實驗中，同時抑制TNF-α及死亡受體能明顯減少小鼠腦組織的損傷面積，且小鼠在空間記憶實驗中的表現也顯著改善[34]。使用程序性壞死特異性抑制劑Nec-1能明顯減輕創傷后腦組織的損傷，腦組織神經細胞的死亡率明顯降低，說明程序性壞死的有效性抑制有助于神經細胞的功能修復[34]。Su等[15]將Nec-1用于小鼠創傷性顱腦損傷模型發現，小鼠神經細胞的程序性壞死明顯被抑制，且可顯著減輕腦損傷、減少腦出血量，改善腦細胞功能，促進神經功能恢復。Bermpohl等[35]研究發現，程序性壞死的有效抑制可明顯減少小鼠創傷后腦損傷的面積，且小鼠的運動功能及在Morris水迷宮中的生存能力等也有明顯改善。You等[36]研究發現，使用Nec-1可使小鼠大腦皮質損傷區域的中性粒細胞明顯減少，同時對活化的小膠質細胞程序性壞死具有抑制作用，故認為Nec-1具有長效的抗損傷作用。

此外，Nec-1可有效減少小鼠腦損傷后神經細胞程序性壞死的發生，但神經細胞也可能發生凋亡或自噬等其他死亡，說明不同死亡方式之間存在著復雜聯系，但創傷性顱腦損傷后神經細胞的程序性壞死被有效抑制并不意味著細胞可以避免死亡[37]。因此，Nec-1聯合凋亡及自噬等抑制劑在創傷性顱腦損傷后保護并促進神經細胞恢復中具有重要的臨床價值。

5 小 結

程序性壞死的信號轉導機制復雜，參與表達及活化的分子較多，并與凋亡及自噬等其他死亡方式有復雜聯系。程序性壞死的信號通路及各種新型抑制劑的不斷深入研究，在眾多動物模型及臨床研究中取得了較大進展，但程序性壞死是一種新的細胞死亡通路，還是其他細胞死亡方式的分支及是否存在程序性壞死的核心通道等，目前其分子機制尚不明確。神經細胞屬于不可再生細胞，雖然在顱腦創傷后的大量神經細胞已無法避免死亡，但抑制程序性壞死對于減少顱腦創傷后因腦組織水腫、缺血缺氧及炎癥反應等所造成的二次損傷具有重要意義，為創傷性腦損傷的臨床治療提供了新方向。