HHIP基因與COPD患者并發肺癌關系的研究進展

許靖，張舒，肖中，王海濤，蔡峰

(上海市第七人民醫院 上海中醫藥大學附屬第七人民醫院呼吸內科，上海 200137)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺癌是吸煙人群最常見的慢性呼吸道疾病。近年來，我國COPD和肺癌的年發病率居高不下，目前COPD患者已達9 990萬，20歲以上人群COPD的患病率達8.6%，2008—2018年，40歲以上人群COPD的患病率增長了67%，40歲以上人群COPD發病率已達10%；預計到2020年，COPD可能成為全球死亡的第三大原因[1]。研究表明，全世界每年新發肺癌約135萬例，肺癌占所有惡性腫瘤的12%，自2008年起居惡性腫瘤發病率的首位，居男性惡性腫瘤的第一位，女性惡性腫瘤第二位[2]。近年來，肺癌每年死亡人數超過100萬，雖然靶向藥物和免疫治療已應用于惡性腫瘤的治療，但肺癌的發病率和病死率仍較高；且COPD患者肺癌的發病率明顯升高，50%～80%的肺癌患者有明確的COPD病史[3]。目前COPD患者并發肺癌的機制尚不清楚。全基因組關聯研究表明，染色體位點15q25、4q31和6q31在有吸煙史肺癌及COPD患者的疾病篩查中顯著重復[4-6]。可見，在染色體位點15q25、4q31和6q31編碼的基因可能是肺癌和COPD共發生的候選基因，染色體位點15q25編碼的煙堿型乙酰膽堿受體基因、染色體位點4q31編碼的Hedgehog相互作用蛋白(Hedgehog-interacting protein，HHIP)和血型糖蛋白A基因是研究較多的與COPD患者肺癌相關的候選基因[7]。其中，HHIP基因作為Hedgehog(Hh)信號通路的關鍵調解因子成為COPD并發肺癌關系的研究熱點。現就HHIP基因與COPD患者并發肺癌關系的研究進展予以綜述。

1 Hh信號通路及HHIP基因的生理作用

Hh信號通路是多種臟器生長發育的重要信號通路。對果蠅胚胎Hh信號通路的研究表明，Hh信號通路參與了胃腸道、肺等多個臟器的組織發生及損傷后修復等病理生理過程[8]。Hh信號通路在胚胎期果蠅胃腸道、肺組織均明顯表達；對于內胚層來源的組織，Hh信號通路在相關組織發育及分化過程中起關鍵作用。研究證實，哺乳動物的Hh信號通路由分泌性蛋白Hh因子3種Shh配體(Shh、Dhh、Ihh)、2個跨膜受體[含12個跨膜結構域的膜蛋白受體Ptch(patched)以及Smo(Smoothen，含1個7次跨膜結構域，屬于G蛋白偶聯受體FZ SMO超家族成員)]和3個轉錄因子(Glil、Gli2、Gli3和下游的靶基因)組成[9]。當Hh蛋白低表達或沉默時，膜蛋白受體Ptch抑制Smo，此時Gli-3與SuFu在細胞質內形成復合物，同時SuFu促進Gli-3水解，從而抑制Gli-l和Ptch的Hh信號通路中目的基因的表達。當Hh蛋白與Ptch結合時，Ptch對Smo的抑制作用被解除，并經過一系列反應引發下游事件[10-11]，因此Gli-1表達被認為是Hh信號通路激活的標志。

Hh蛋白激活HHIP基因的表達，進而反饋抑制Hh信號通路的活性。激活的HHIP基因生成相應HHIP蛋白，與Hh信號通路中分泌性蛋白因子Hh因子結合，導致Hh因子無法與Rtch結合并失活[12]。此負反饋調節機制是組織正常發育所必需，如哺乳動物肺組織發育過程中，通過Hh信號通路反饋激活HHIP蛋白，HHIP蛋白與Shh蛋白結合可抑制Hh信號通路的活化，當Hh信號通路表達受到抑制，成纖維細胞生長因子及Wnt等信號通路出現表達，進一步誘導肺芽形成[13]。動物實驗表明，HHIP基因干擾小鼠支氣管分支和肺泡上皮分化出現明顯的形態改變和肺組織發育不全；敲除HHIP基因小鼠的Hh信號通路持續活化，小鼠出生后因肺發育不全導致呼吸窘迫而死亡[14]。

2 COPD患者發生肺癌的關鍵分子學機制

Hh信號通路持續異常活化可能是COPD患者發生肺癌的關鍵分子學機制。COPD患者往往存在吸煙史，甚至是長期吸煙史。COPD患者吸煙過程中所產生的尼古丁等多種有害物質可通過局部炎癥反應破壞呼吸道上皮的防御機制，進而損傷呼吸道上皮，導致Hh信號通路再次被激活。有學者認為，Hh信號通路再激活與尼古丁等有害物質對氣道上皮產生損傷的免疫應答相關[15]。激活的Hh信號通路通過調控呼吸道上皮干細胞及祖細胞的定向分化使再生的肺間質細胞分化為平滑肌細胞和呼吸道上皮細胞，促進呼吸道受損上皮的完整修復[16-17]。和胚胎發育期一樣，Hh信號通路可被其激活的HHIP基因表達產物負反饋調控，若HHIP基因異常表達下調，可能導致Hh信號通路負反饋機制異常，使上述分化過程失調，導致呼吸道上皮細胞分化缺陷，從而進一步加重氣道重構及肺泡結構破壞。研究發現，HHIP基因下調小鼠出生后，其小腸上皮呈泛平滑肌化[18]。小氣道泛平滑肌化可能影響氣道平滑肌的厚度，可在一定程度上引起氣流受限，進而導致肺組織結構塌陷引起肺通氣功能障礙。Zhou等[19]對COPD患者肺組織與正常肺功能吸煙者肺組織中的HHIP基因表達水平進行研究發現，COPD患者肺組織信使RNA(messenger RNA,mRNA)和蛋白的表達水平均較后者顯著降低。

若Hh信號通路持續處于激活狀態，將出現Shh、Glil及Gli2過度表達，細胞增殖紊亂進一步加重，甚至可能導致惡性腫瘤的發生[20]。上皮細胞中再激活的Hh信號通路需要HHIP基因的負反饋抑制。Hh信號通路的異常持續活化及HHIP表達下調與包括肺癌在內的多種惡性腫瘤相關，約1/3的人類腫瘤需要Hh信號通路的活化來維持腫瘤細胞的生存活性[20]。研究表明，肺癌患者手術切除組織可檢測到Hh信號通路中Shh和Glil的異常高表達[21]。進一步研究發現，肺癌組織中HHIP基因出現不同程度的表達下調，提示無論何種原因引起的HHIP基因反饋抑制Hh信號通路活化功能缺失均可導致Hh信號通路持續活化，這可能是肺癌細胞不斷增殖、生長的主要原因之一[20]。Shh抗體可阻斷Hh信號通路的持續活化，抑制腫瘤細胞生長，促進其凋亡[22]。研究發現，HHIP基因在肺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等癌組織中均有不同程度的表達下調或沉默，故推測HHIP基因表達下調進而負反饋抑制Hh信號通路持續活化是導致COPD患者肺癌發生的重要分子學基礎之一[23]。

3 COPD患者HHIP基因表達下調的可能原因

多種原因可導致COPD患者HHIP基因表達下調，如HHIP基因本身轉錄減少、HHIP基因中增強轉錄活性的蛋白下調、抑制HHIP基因作用的蛋白增加，若涉及表觀遺傳學則可能與HHIP基因啟動子附近甲基化增加，或基因附近組蛋白的甲基化乙酰基化改變，或外源物質在基因或啟動子區與結合抑制蛋白結合等有關。

3.1HHIP基因的單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphism，SNP)變化 SNP是指個體基因組內某一特定核苷酸位置序列上單個堿基的轉換、顛倒等現象，可導致COPD患者HHIP基因表達下調，引發肺癌。研究發現，約20%的COPD患者罹患肺癌[3]。目前，尚無研究證實COPD患者的HHIP基因存在重大突變。不同遺傳學背景COPD患者的肺癌發生風險存在差異，而SNP是影響疾病發生發展的最常見的個體遺傳學因素之一。Wang等[24]發現，6p21.1、9p21.3和12q13.13的SNP位點rs7741164、rs72658409和rs11610143與亞洲非吸煙女性肺癌易感性相關。

有研究表明，HHIP基因位點rs1489759與COPD患者發生肺癌的關系密切[25]。但不同種族人群的遺傳背景存在較大差異，因此對不同種族人群的相關重復研究具有重要意義。一項對1 017例中國漢族COPD患者的研究顯示，HHIP基因多態性位點rs768942純合子基因型的COPD患者發生肺癌的風險顯著降低，而歐美COPD患者內含子位點rs1489759在漢族人群的研究中卻未見與肺癌發生有關聯性[26]。

內含子含有核仁小RNA和微RNA等多種非編碼RNA，還有參與基因轉錄、mRNA加工和蛋白質空間結構等表達的調控元件[27-30]。多種疾病的發生、發展與內含子突變密切相關，如突變發生在內含子與外顯子交界(即GU或AG)，則有可能導致內含子剪切異常，進而導致外顯子的缺失或突變，從而引起相關疾病[31-32]。發生于內含子中間序列的突變可能通過激活隱性剪切位點影響外顯子的剪切，導致疾病。研究表明，細胞色素P450 IA2基因的高誘導性及靶向性與該基因第1個內含子中的C/A多態性密切相關[33]。真核生物mRNA內含子對基因表達的調控不僅發生在前體RNA的剪接階段，還可發生在轉錄、RNA編輯、mRNA出核運輸、mRNA翻譯和無義衰變等過程中[34-35]。另有研究表明，對于本身不含內含子或不需要內含子參與表達的基因，若其mRNA內出現內含子，則轉基因生物的基因表達效率明顯提高[36-37]。目前，對于HHIP基因SNP與COPD患者肺癌發生的關聯性尚缺乏細胞學研究的進一步論證。

3.2HHIP基因DNA啟動子區的異常高甲基化 COPD患者HHIP基因DNA啟動子區的異常高甲基化導致其表達下調或沉默。有研究表明，與癌旁組織相比，合并COPD史的非小細胞肺癌患者腫瘤組織中HHIP基因啟動子區呈現顯著高甲基化；此外，患者腫瘤組織中HHIP基因表達顯著低于癌旁組織，Hh信號通路異常活化，提示COPD并發非小細胞肺癌患者HHIP基因啟動子區的高甲基化可導致HHIP基因表達下調或沉默，進而導致Hh信號通路的異常活化，最終導致腫瘤的發生、發展[21]。DNA甲基化是基因表觀遺傳學修飾的重要方式之一，其指在DNA甲基化酶的作用下，胞嘧啶(C)5位碳原子上加入一甲基基團而成為5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程。在哺乳類生物基因組中，存在5%～10%的CpG島，其中70%～80%是mCpG，CpG二核苷酸的聚集稱為CpG島，主要位于異染色質區，呈高度甲基化，基因組中約50%的基因調控區存在CpG島[38-39]。在胃腸道腫瘤中，HHIP基因啟動子區也呈明顯高甲基化，且Hh信號通路異常活化。在各種惡性腫瘤中，多種抑癌基因(Rb、VH-L、p16、p15等)啟動子區呈明顯高甲基化狀態，且表達下調甚至沉默。將以上抑癌基因去甲基化，其表達恢復，并可導致惡性腫瘤的表型逆轉。正常細胞導入外源性DNA甲基轉移酶基因后可出現惡性腫瘤傾向[40-41]。但目前尚缺乏對肺癌細胞細胞層面HHIP甲基化的相關研究，仍有待進一步研究。

4 HHIP基因與COPD患者并發肺癌關系的相關研究

目前，缺乏HHIP基因與COPD患者并發肺癌相關的確切依據，在非小細胞肺癌的相關研究中，關于 HHIP基因及Hh信號通路與肺癌關系的研究結果仍存在矛盾。Watkins等[42]的研究表明，非小細胞肺癌組織中Hh信號通路的激活僅占非小細胞肺癌腫瘤組織及細胞系的10%左右，在多個非小細胞肺癌細胞系中均未檢測到Hh信號通路的異常活化。Chi等[43]的研究發現，僅不到10%的非小細胞肺癌組織存在Hh信號通路的異常活化。Savani等[44]對42例非小細胞肺癌患者肺癌組織Hh信號通路因子Shh、Ptch1、Glil、Smo表達情況的研究發現，Shh、Ptch1、Glil和Smo在非小細胞肺癌組織中呈陰性或弱陽性表達，甚至較正常肺支氣管組織上皮細胞中的表達更少。故認為Hh信號通路的致肺癌作用遠遠小于其在正常肺上皮組織生長發育中的作用。但Hh信號通路在非小細胞肺癌組織中存在異常活化，且較普遍。Yuan等[45]研究顯示，Hh信號通路在非小細胞肺癌組織及其細胞系中均高度激活，有些肺癌細胞系對Hh抑制劑的敏感性較低，可能與Hh信號通路過度激活導致Hh抑制劑無法發揮作用有關；進一步采用RNA干擾技術下調GL1水平發現，使用Hh抑制劑即可顯著抑制Hh信號通路的活化及腫瘤細胞的生長。Gialmanidis等[46]的研究亦顯示，大多數非小細胞肺癌存在Hh信號通路的激活。可見，肺癌患者存在Hh信號通路的異常活化。

5 小 結

COPD并發肺癌患者存在HHIP基因表達下調及異常活化的Hh信號通路，但具體機制尚不清楚，可能與HHIP基因內含子的SNP變化及表觀遺傳學異常有關。HHIP基因及Hh信號通路在肺癌組織及細胞的研究結果仍存在矛盾，不同肺癌細胞系的研究結果仍有爭議。目前國內外對HHIP基因的研究主要集中于胃癌及胰腺癌等消化道腫瘤，對其在肺癌發生發展中作用機制的研究較少，仍需要進一步研究。