9p21 位點多態性與腦卒中相關性的研究進展

鐘成清，楊麗立，舒鑫，王普，余能偉

(1.成都市第七人民醫院神經內科，成都610041;2.四川省醫學科學院 四川省人民醫院神經內科，成都610072;3.綿陽市第三人民醫院神經內科，四川 綿陽621000;4.崇州市人民醫院神經內科，四川 崇州611230)

腦卒中作為一組以局灶性神經功能缺失為特征的高致死、高致殘性急性腦血管疾病，已成為目前嚴重威脅人類健康的主要疾病，分為出血性和缺血性。目前公認的腦卒中危險因素包括高血壓、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥、血脂異常、吸煙、心房顫動、肥胖等，只有吸煙為可完全控制的危險因素，其他危險因素可通過藥物、運動和飲食習慣調整等部分改善。部分腦卒中可能與遺傳因素導致的個體差異有關。隨著遺傳學的飛速發展，腦卒中的遺傳學研究逐漸成為近年來的研究熱點。研究顯示，遺傳和環境因素在腦卒中的發生、發展中有著重要影響［1］。以單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)為基礎的全基因組關聯研究(genome wide association study，GWAS)是當今復雜性疾病強有力的研究手段，已經發現大量易感位點和易感基因，其中染色體9p21.3 基因座已被證實存在某些疾病［如心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)［2］、缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)［3］、主動脈瘤［4］、顱內動脈瘤［5］、原發性開角性青光眼［6］、2 型糖尿病［7］、膠質瘤［8］、腫瘤易感性［9］］的易感位點，提示染色體9p21 中存在重要的不穩定的基因座。現就9p21 位點多態性與腦卒中相關性的研究進展予以綜述。

1 9p21 位點多態性常用研究方法

遺傳多態性通常是指同一生物群體中，兩種或以上的變異類型或基因型并存的現象，同時，這種變異型的數量保持在相對穩定的比例［10］。SNP 主要是指在基因組水平上單個核苷酸發生變異所引起的DNA 序列多態性［11］，其具有分布均勻、數量大、穩定性高、自動化分析便捷等特點［12］，是重要的基因遺傳標記，能準確識別有關區域的易感基因。

近年來，以SNPs 為基礎的GWAS 已成為研究復雜性疾病易感位點和基因的主要檢測方法。GWAS的基本策略是用基因芯片在全基因組范圍內同時對數十萬乃至上百萬個SNP 進行檢測，通過病例對照關聯分析，在不同的群體及大樣本中進行多階段重復驗證并整合結果，從而篩選出與疾病關聯的常見變異。GWAS 已成功發現多個與人類常見疾病有很強關聯性的SNPs，據國際人類基因組研究所和歐洲生物信息研究所統計，截至2015 年6 月，共有2 000 多篇GWAS 研究被收錄，累計發現15 000 個SNPs 位點與約8 000 相關性狀或疾病相關［13-15］，但被發現的相關位點的作用效應很微弱，不能完全解釋這些疾病的遺傳風險，很難直接定位致病變異，尤其涉及家系和個體中的稀有或低頻變異時，GWAS 很難發現［16］。隨著科學技術的發展，以外顯子測序技術為主的高通量測序得到了蓬勃的發展，它能發現與疾病相關的低頻變異、罕見變異和新的基因，正好與GWAS 發現常見變異形成互補［17］。有研究發現，罕見變異在復雜疾病遺傳作用的生物學功能可能更大［18］。高通量測序技術的不斷創新和發展，為進一步探究多基因復雜疾病打開了新的思路，為深入了解人類疾病發生的遺傳機制提供了重要線索和科學依據。

2 9p21 概述

9p21 區域DNA 序列全長約為175 kb，具有高度連鎖不平衡性，主要有甲硫腺苷磷酸化酶(methylthioadenodine phosphorylase，MTAP)、細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitive factor，CDKN)2A 和CDKN2B、ANRIL(antisense non-coding RNA)等基因［19］。MTAP 在甲硫氨酸和嘌呤的合成補救中起關鍵酶作用，并參與多胺代謝途徑，生成DNA、ATP 和甲硫氨酸，最終在細胞的DNA、能量、蛋白質合成中起重要作用，參與細胞的新陳代謝，另外，MTAP 的缺失與腫瘤形成相關［20］。也有學者研究發現，在中國漢族人群中MTAP 基因中的SNP 位點與冠心病、IS 的患病相關［21］。CDKN2A 編碼蛋白質p16INK4a(p16 inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a)和p14ARF(p14 alternative reading frame)，CDKN2B編碼蛋白質p15INK4b，這些蛋白質均參與細胞周期調控、老化、衰老、凋亡，并與動脈粥樣硬化形成有密切關系，當然CDKN2A 和CDKN2B 也是抑癌基因［22］。ANRIL 是INK4 位點上一段長約126.3 kb 的反義非編碼RNA，與其他3 個主要基因有部分重疊，與CDKN2B轉錄的方向相反，有研究還表明，ANRIL 可調節鄰近基因CDKN2A/2B 表達，也可能通過某種機制干預遠距離靶基因的表達，是目前各國科學家研究9p21 的一個重要位點［23］。ANRIL 被認為是原癌基因，參與胃癌、肺癌、肝癌、食管鱗狀細胞癌的形成，ANRIL 沉默可以抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，在各種腫瘤中ANRIL 表達升高，可以作為某些腫瘤的診斷和預后標志物;另外，ANRIL 已經成為CVD 的重要遺傳易感基因，該位點的眾多SNP 與CVD 發病風險直接相關［24-25］。

3 IS 與9p21

腦卒中是目前我國居民疾病死亡的第一大原因［26］。盡管目前加強了卒中的預防，提高了診斷水平，治療措施也不斷改進，但腦卒中仍表現為高發病率、高致殘率和高病死率，而且世界衛生組織預計，到2025 年腦卒中發病率會增加27%，對人類社會的健康造成巨大危害，給患者和社會帶來嚴重的經濟負擔［27-28］。腦卒中分為IS 和出血性腦卒中，IS 約占全部腦卒中發病率的80%［29］，是受遺傳、環境和血管危險因素相互作用而引起的一種多因子復雜疾病［30］，大約一半的發病可以用傳統危險因素解釋，如缺血性心臟病、高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙及心房顫動等［31］。越來越多的研究表明，遺傳因素在IS 發展中起著非常重要的作用［32］，但國內外學者研究9p21 與IS 是否相關聯，得出的結論卻不一致。

Matarin 等［33］在249 例IS 白種患者及268 例對照中用GWAS 檢測了超過40 萬個特殊SNPs，結果沒有一個位點與卒中風險密切相關，但卻首次發現了9p21 染色體上的CDKN2A 與IS 存在某種微弱關聯。后來大多數研究證實了9p21 確實可增加IS 的發病風險［34-35］，但另有研究發現，9p21 與IS 之間不存在這種關聯性［36-39］;多項薈萃分析也顯示，9p21中相關位點是IS 的危險因素，尤其與大動脈粥樣硬化型(large artery atherosclerosis，LAA)卒中存在顯著的關聯［40-42］。Lu 等［43］在528 例非心源性IS 患者(375 例合并頸動脈斑塊，153 無頸動脈斑塊)、258 名健康對照者中對9p21 區域中的6 個SNPs 進行了檢測，結果發現，rs2383206、rs4977574 的G 等位基因是IS 的風險等位基因，且中年人群中的無頸動脈斑塊組攜帶該基因人數顯著多于正常對照組;含有GG 純合子的個體比含AG/AA 基因型具有顯著增加IS 風險效應;另外，該研究還發現，65 歲以上IS 患者rs2383206、rs4977574 的G 等位基因與頸動脈斑塊發生風險相關。L?vkvist 等［44］也在3 986 例IS 患者和2 459 名健康對照者中證實了9p21 上的SNP rs4977574 與IS 相關。Bi 等［45］指出染色體9p21 是IS 的一個易感基因，其變異產生的影響可能會隨著年齡的變化而發生改變;該研究第一次證明了rs10757278 GG 基因型、rs1537378-C 等位基因、rs1333047TT 基因型與中國漢族人群IS 相關聯;同時還發現，在IS 中rs10757278-GG 攜帶者血漿總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平顯著增加，在納入對照組后差異仍然有統計學意義(P ＜0.05)，從而推測rs10757278 變異可能對血脂水平有不同程度的影響，同時有rs10757278-G等位基因變異和血脂異常的人可能患IS 的易感性更高，基因型對于血脂水平的影響一定程度上會干預IS 的進程。最近的一篇關于rs10757274 的薈萃分析(納入10 個研究，6 746 例病例及12 577 例對照)顯示，按種族分組的亞組分析中rs10757274G 等位基因攜帶者發生IS 的風險增加(包含亞洲人和高加索人);進一步對rs10757274 與LAS 進行相關性分析表明，等位基因或GG 基因型增加了亞洲人LAS 的發病風險(等位基因模型:OR =1.18，95%CI 1.06 ～1.1，P=0.002;隱性模型:OR =1.33，95%CI 1.12 ～1.57，P=0.001)［46］。2015 年，Carty 等［47］在《Stroke》上發文，第一次針對GWAS 研究中的14 746 例非洲裔美國人(含1 365 例IS、1 592 例混合型卒中)進行了薈萃分析，對達到P ＜10-6的相關基因位點在歐洲血統人群缺血性腦卒中遺傳研究聯盟(METASTROKE)上進一步驗證，結果表明，在非洲裔美國人身上發現了一個新的與血脂水平和高血壓有關的基因變異，即基因15q21.3 位點上rs4471613發生了變異，該變異與所有的卒中相關(P =3.9 ×10-8)，在歐洲人群中已證實與IS 相關的易感位點可能也與之相關。2015 年，美國國立神經病學與卒中研究所和國際卒中遺傳學聯合會分2 個階段做了一個大規模GWAS 識別卒中及其亞型易感基因的研究，結果在1p13.2 位點的TSPAN2 附近發現了一個新的與LAA 相關的基因座(G 等位基因位于rs12122341);同時研究結果也支持之前被多次報道的4 個位點(包括PITX2、ZFHX3、HDAC9、12q24)與IS 密切相關，但以前研究發現的相關易感基因NINJ2、9p21.3 均未被證實［48］。2015 年，另一篇發表在《Stroke》的文章試圖在LAA、心源性腦栓塞(cardio-embolism，CE)和小血管閉塞(small vessel occlusion，SVO)3 種IS 亞型中尋找共同的易感基因，該研究共納入12 389 例IS 患者(包括2 167 例LAA、2 405 例CE 和1 854 例SVO)和62 004 例對照組，結果發現，在LAA 與SVO 型之間有很高的遺傳相關性，LAA 與CE、SVO 與CE 只有在混合線性模型下才有微弱的關聯;隨后又對LAA 和SVO 進行了薈萃分析，發現6q25.2 上OPRM1 的rs17084671(P=1 ×10-7)與之有很強的關聯，可能是LAA、SVO 的共享遺傳基因［49］。S?derholm 等［50］對瑞典南部人群(IS 組2 385 例，對照組6 077 例)進行了外顯子測序，結果沒發現與之相關的易感位點和易感區域。其他證實過與IS 相關的易感基因有APOE(E2/E3/E4)基因［51］、10q25 上HABP2 附近rs11196288［52］、12p13 上rs12425791［53］、9q34.2 上ABO 和7p21.1上HDAC9(與LAA 卒中相關)、PITX2 和ZFHX3 基因(與CE 型卒中相關)［54］以及血管緊張素轉換酶基因(與非CE 型卒中相關)等［55］。針對以上眾多學者關于9p21 與IS 的關聯性研究結果不一致的情況，推測腦卒中是一種異質性疾病，據TOAST(trial of org 10172 in acute stroke treatment)病因學分型，分為LAA、CE、SVO、其他病因確定的卒中、不明原因型5 個類型，各個亞型分別有獨特的病因、危險因素、遺傳特征，甚至亞型之間也可能有共同的遺傳成分;不同地區、種族、人群之間也可能有不同的基因分布特點，存在表達差異;一些研究樣本量偏小，有不同情況的選擇偏倚，忽略了其他因素對IS 的影響，造成了假陽性的結果。

4 動脈瘤與9p21

2008 年，隨著9p21 上10757278-G 與冠心病、rs10811661-T 與2 型糖尿病相關聯的報道出現，Helgadottir 等［4］試圖去探尋兩基因位點與動脈瘤的關系，結果第一次在歐洲人群中證實了9p21 上的rs10757278-G 與腹主動脈瘤和顱內動脈瘤相關。同年，Bilguvar 等［56］在涉及芬蘭、荷蘭、日本人群的2 100 例顱內動脈瘤和8 000 例對照分析中，不僅證實了9p21 上的CDKN2A 與動脈瘤有很強的相關性，還新發現了染色體2q、8q 也與之相關。Foroud 等［57］首先在白色人種2 617 例顱內動脈瘤和2 548 例對照組中進行基因分析，同時進一步薈萃分析，結果又新發現了一個與顱內動脈瘤相關的位點，即第7 號染色體上HDAC9 的rs10230207，同時也證實了9p21 上CDKN2BAS 的rs10733376 與顱內動脈瘤的相關性。Loinard 等［58］在小鼠上剔除9p21 非編碼區上心血管風險區間，結果促進了動脈瘤的生長，從而證明了染色體9p21 與動脈瘤易感性有直接關系。Kurki等［59］通過大樣本、多中心病例對照分析研究發現，9p21.3、2q23.3、2q33.1、5q31.1 和6q24.2 與囊狀動脈瘤相關。Abrantes 等［60］研究發現，rs4667622(UBR3 和MYO3B 之間)、rs6599001(3p22.2 上SCN11A和WDR48 之間)、rs3932338(5p14.2 上PRDM9 下游)、rs10943471(HTR1B 上游)、rs1333040(9p21)與顱內動脈瘤相關，而且新發現的前4 個位點與顱內動脈瘤的關聯性比rs1333040 更強。van't Hof 等［61］在3 個GWAS 關于動脈瘤的隊列研究中(顱內動脈瘤1 516 例，對照組4 305 例;腹主動脈瘤818 例，對照組3 004 例;胸主動脈瘤760 例，對照組2 212 例)試圖尋找共同致病基因，結果在3 種動脈瘤之間沒有發現一個與之顯著相關的共同致病基因，只是發現18q11 附近的RBBP8 是顱內動脈瘤和腹主動脈瘤的風險基因，15q21 附近的FBN1 是主動脈瘤和腹主動脈瘤的風險基因。我國也有學者去探究動脈瘤與染色體9p21 之間的關系，張利通［62］在天津地區的119 例顱內動脈瘤患者及257 例對照者中分析了22 個基因區域的28 個SNP 位點，結果只發現了糖尿病相關基因SLC2A9 上rs7660895 和TOX 基因上rs11777927 是顱內動脈瘤的易感基因。Wei 等［63］在155 例腹主動脈瘤和310 例對照組中發現，9p21.3 上的rs10757278-G、rs1333049-C 顯著增加了腹主動脈瘤的患病風險。Nakaoka 等［64］通過研究發現，9p21 對顱內不同位置的動脈瘤影響不一樣(后交通動脈部強于前交通動脈)，隨后又在動脈瘤未破裂組和破裂組之間比較基因的表達譜，探究誘發動脈瘤破裂的生物機制，結果發現，S100A8、S100A9、S100A12表達水平的下調會導致動脈瘤血管壁變薄，抗炎因子Krüppel 樣轉錄因子(krüppel-like transcription factor，KLF)2、KLF12、KLF15 和CDKN2A 的下調也與動脈瘤相關。9p21 引起動脈瘤的具體機制尚不清楚，需要廣大學者更深入的研究，血管壁結構改變可能是其中之一。

5 小 結

9p21 區域在多種復雜疾病的病理生理機制中可能發揮重要的作用，9p21 區域上存在多個疾病易感位點，這種現象集中在疾病共同的機制上，尤其是血管性疾病，揭示了該區域與血管相關性疾病的密切聯系。全面準確地查找腦卒中的危險因素，做好針對性的預防措施，將顯著減輕腦卒中導致的嚴重社會及家庭負擔。通過基因檢測或預測模型將高危人群從一般人群中精確篩選出來將對疾病的防治起到積極作用，也為個體化治療提供基因證據和靶點。為此，有必要開展廣泛人群的基因篩查和健康人群對照，建立流行病數據庫有助于更全面地收集遺傳信息，減少卒中的發生。