膠質母細胞瘤替莫唑胺耐藥機制的研究進展

楊國榮，封林奇，顧錦濤，賈博，穆楠

(1.空軍軍醫大學基礎醫學院學員一大隊，西安 710032； 2.空軍軍醫大學腫瘤生物學國家重點實驗室藥學院生物制藥學教研室，西安 710032； 3.空軍軍醫大學第一附屬醫院神經外科，西安 710032；4.空軍軍醫大學基礎醫學院生理與病理生理學教研室，西安 710032)

腦膠質瘤是成人中樞神經系統最常見的顱內原發惡性腫瘤，包括星形膠質細胞瘤、少突膠質細胞瘤、室管膜瘤和混合性膠質瘤4種類型，而在星形膠質細胞瘤中級別最高的膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的成人顱內惡性腫瘤，世界衛生組織分級達到Ⅳ級[1]。GBM呈浸潤性生長，常侵犯周圍正常組織，手術完全切除非常困難，復發率高[2]。目前，臨床對于GBM的治療普遍采用最大安全范圍手術切除、替莫唑胺(temozolomide，TMZ)化療及輔助性放療相結合的方案，但患者的中位生存期仍無明顯延長[3]，且GBM患者相較于其他類型的膠質瘤患者更易對TMZ產生耐藥[4-5]。因此，如何減少GBM患者的TMZ耐藥作用，提高GBM患者的化療敏感性，降低患者腫瘤的復發率，是GBM臨床治療急待解決的問題。現有的研究顯示，DNA損傷修復、細胞自噬和膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)等途徑廣泛參與GBM發生、發展的腫瘤生物學進程，并直接介導了TMZ耐藥產生[6-7]。現就GBM TMZ耐藥機制的研究進展予以綜述。

1 DNA損傷修復與TMZ耐藥

TMZ屬于烷化劑，口服生物利用度近乎100%，且易透過血腦屏障，為目前治療GBM的一線化療藥物。TMZ進入腫瘤細胞后其分解產物可導致DNA的甲基化，進而干擾細胞的DNA復制，造成DNA損傷，達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。但是在GBM細胞中存在極強的DNA損傷修復系統和復雜的損傷修復機制，這些修復機制是介導GBM對TMZ產生耐藥的重要原因。目前認為，TMZ耐藥是 O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methyl-guanine-DNA-methytransferase，MGMT)、錯配修復(mismatch repair，MMR)、堿基切除修復(base excision repair，BER)等DNA損傷修復系統以及自噬、腫瘤干細胞等共同作用的結果[8]。而在GBM的DNA損傷修復方面，新近的研究主要集中于MGMT、MMR以及一些具有調控DNA損傷修復功能的基因方面。

1.1MGMT介導的GMB耐藥 MGMT的主要作用是在TMZ造成腫瘤細胞DNA損傷之前逆轉TMZ對DNA的甲基化作用，它可以直接從鳥嘌呤O6的位置上去除烷基基團，導致TMZ治療失效，而GMB細胞中MGMT表達相對穩定且較其他類型膠質瘤高[9]。因此，闡明調控MGMT的關鍵分子和信號通路，成為TMZ耐藥領域的研究熱點。

1.1.1MGMT陽性GBM與TMZ耐藥 MGMT啟動子甲基化與MGMT基因的表達密切相關，MGMT啟動子甲基化后可直接抑制MGMT基因的轉錄。Tezcan等[10]發現，歐油菜葉提取物通過促進MGMT啟動子甲基化，協同增加了GBM的TMZ反應，提高了TMZ敏感性；此外，歐油菜葉提取物還可能通過下調p53抑制GBM細胞，從而將TMZ的作用機制從典型的誘導細胞凋亡轉變為激活線粒體死亡通路或壞死。

此外，Yang等[11]發現，沉默特異AT序列結合蛋白1基因也可以引起MGMT表達的下調和SLC22A18表達的上調，從而緩解GBM的TMZ耐藥，提示特異AT序列結合蛋白1基因對MGMT介導的TMZ耐藥具有重要意義。然而，MGMT啟動子甲基化有時與MGMT表達水平并不一致，提示可能有新的基因表達調控機制存在。如Chen等[12]報道了一個名為“K-M增強子”的增強子，它是一個具有調節MGMT表達功能的遠端增強子，K-M增強子的激活可以“繞過”MGMT啟動子甲基化，激活MGMT的轉錄。這一發現有助于解釋部分GMB細胞中MGMT啟動子甲基化與其表達水平不一致的情況，還可以解釋部分MGMT啟動子甲基化較高的GMB患者預后仍較差的問題。因此，MGMT基因的表達調控不僅僅依賴于啟動子甲基化修飾這一表觀遺傳學水平，一些基于MGMT基因的轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平的調控機制研究將有助于更好地回答MGMT基因對TMZ治療的影響。

1.1.2MGMT陰性GBM與TMZ耐藥 具有MGMT表達的GBM患者對TMZ治療具有先天的耐藥性，但MGMT基因缺陷的GBM患者也不一定對TMZ敏感。Yi等[13]研究發現，經過持續的TMZ治療后，大多數最初對TMZ敏感的MGMT陰性GBM患者也會產生TMZ耐藥；進一步研究發現，脫氫膽甾醇2(dehydrocholesterol 2，DHC2)的表達是MGMT缺陷細胞獲得TMZ耐藥性的關鍵調控分子，而且在復發性MGMT缺陷的TMZ抵抗性GBM患者的腫瘤組織中DHC2表達顯著增強。其機制主要是持續的TMZ治療誘導了GBM的細胞骨架重排，繼而誘發DHC2的表達；抑制DHC2的表達可以增強TMZ誘導的DNA損傷，提高MGMT陰性的GBM細胞對TMZ的敏感性，但該調控通路在MGMT陽性患者的GBM細胞中并不顯著[14]。此外，脫氫表雄酮可通過降低MGMT陰性GBM細胞的DNA損傷阻止TMZ誘發的細胞凋亡，其主要機制是脫氫表雄酮激活LYN-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)級聯反應，促進Sp1(specificity protein 1)磷酸化，磷酸化的Sp1定位于TMZ損傷的DNA，進而阻止了進一步的DNA損傷，同時磷酸化的Sp1還能募集組蛋白去乙酰化酶來完成去乙酰化，去乙酰化的Sp1可以招募增殖細胞核抗原來減弱DNA損傷，降低TMZ的毒性[15]。

1.2MMR介導的TMZ耐藥 MMR作為DNA修復機制的一種，發生在DNA損傷后。MMR可以拮抗TMZ對GBM細胞的損傷作用，修復發生損傷的DNA，導致GBM對TMZ的敏感性降低。新近的研究發現，在進行DNA損傷修復的過程中存在不成功的MMR，這種不成功的MMR發揮與MMR截然相反的作用[16]。在TMZ的甲基化靶點中，DNA的鳥嘌呤O6是極為關鍵的一個，鳥嘌呤的甲基化可以引起堿基錯配，而在DNA復制時不成功的MMR可將新合成鏈中錯配的胸腺嘧啶(O6-甲基鳥嘌呤-胸腺嘧啶)識別并切除，從而導致DNA雙鏈缺口形成，隨著DNA復制的進行DNA損傷不斷積累，引起細胞周期停滯，啟動細胞的凋亡，以此來增加TMZ的敏感性；而MMR的功能缺失會導致錯配修復無法進行，若O6-甲基鳥嘌呤-胸腺嘧啶的錯配一直存在，則會引起更多的堿基錯配，最終導致基因突變，GBM的進展加快，使得腫瘤細胞對TMZ產生耐藥[17]。因此，無論是不成功的MMR還是MMR缺陷都使得GBM對TMZ治療產生耐藥。研究發現，對于MMR缺陷所致的TMZ耐藥的GBM，通過提高極樣激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)的表達可以抑制其生長[18]。另外，Stritzelberger等[16]發現，洛莫司汀也可克服由MMR缺陷所引起的TMZ耐藥，另外，當過量的O6-甲基鳥嘌呤導致MGMT飽和時，錯配的堿基也會觸發這種重復但不成功的MMR，進而誘導凋亡。而相較于MMR，BER是修復DNA堿基損傷的主要DNA修復途徑，有研究發現，激活的C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白8-松弛素/胰島素樣肽受體1-信號轉導及轉錄激活因子3通路可以促進GBM細胞的BER，并導致對TMZ的耐藥[19]。

1.3調控DNA修復的基因 TMZ引起的DNA甲基化并不能直接觸發GBM細胞的死亡，它需要在甲基化后通過DNA復制和MMR來積累DNA損傷，最終導致DNA雙鏈斷裂的形成，而在此過程中X線修復交叉互補基因3(X-ray repair cross complementing gene 3，XRCC3)起關鍵調控作用。在生理情況下，XRCC3對于維持基因組完整性和細胞的存活至關重要，而在高級別的膠質瘤中XRCC3表達水平升高，過表達的XRCC3可通過同源重組促進雙鏈斷裂的修復，繼而保護GBM細胞免受TMZ誘導的細胞死亡、凋亡和細胞周期抑制，直接參與TMZ耐藥的形成；XRCC3剔除后，TMZ引起的雙鏈斷裂修復概率顯著降低，GBM對TMZ的敏感性大幅提升[20]。此外，α-地中海貧血/精神發育遲滯綜合征(α-thalassemia mental retardation syndrome X-linked,ATRX)基因也可通過調節DNA的損傷修復來參與GBM的TMZ耐藥，ATRX基因剔除可抑制DNA的復制和損傷修復，進而抑制GBM的生長和侵襲，增加TMZ治療的敏感性[21]。因此，ATRX基因的表達也是膠質瘤患者預后更好、生存時間更長的標志。ATRX基因發揮作用的具體機制是：ATRX表達的抑制導致36位賴氨酸位點的三甲基化修飾的組蛋白H3(H3K36me3)降低，而H3KPme3是毛細血管擴張性共濟失調突變(ataxia telangiectasia mutated，ATM)信號通路的重要參與者，H3KPme3的減少降低了ATM的乙酰化，導致TMZ誘導的ATM信號通路的激活受到抑制，而ATM信號通路又是重要的DNA修復機制，其抑制使DNA修復減少，TMZ對細胞的殺傷效果增強；反之，ATRX基因表達的升高可以增強ATM信號通路的激活，導致TMZ耐藥的發生[21]。此外，有研究發現，生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45A(growth arrest and DNA damage inducible protein 45A，GADD45A)作為一種應激蛋白，在TMZ作用于GBM時通過促進DNA的修復保護了GBM細胞，導致TMZ耐藥的形成；細胞暴露于基因毒性環境中時，GADD45A被激活，導致G2/M細胞周期檢查點的執行，從而為DNA修復提供時間，活化的GADD45A通過與增殖細胞核抗原和脫嘌呤嘧啶核酸內切酶相互作用促進DNA的損傷修復，導致TMZ耐藥的發生，其具體機制可能與p53通路有關[22]。

2 腫瘤細胞自噬與TMZ耐藥

2.1細胞自噬概述 細胞自噬是降解受損或退化的細胞器或受損蛋白質的一種亞細胞過程，是細胞應對不良外界環境的應激反應[23]。細胞自身可以利用降解所產生的物質來維持細胞內能量代謝的平衡，其次這種溶酶體介導的反應也可以將受損細胞降解以維持其他正常細胞的存活[24]。目前大量研究證實，自噬可能是腫瘤細胞面對治療壓力時的促生存反應，自噬可通過促進腫瘤細胞的密集增殖幫助腫瘤細胞抵御多種不利的環境因素(如化療藥物、放射線等)，從而使腫瘤細胞在某些治療中存活[25]。但是過度的自噬則會導致細胞死亡，稱為自噬性細胞死亡或Ⅱ型程序性細胞死亡[23]，因而抑制細胞自噬可以降低這種形式的細胞死亡。

2.2自噬與TMZ耐藥 關于自噬在GBM的TMZ耐藥中發揮的作用目前仍不明確，對于自噬與TMZ耐藥的關系也一直存在很大爭議。少部分的報道認為，誘導自噬可以提高TMZ的細胞毒性，而抑制自噬則會降低療效；但大部分部分觀點認為，抑制自噬可以增加TMZ化療的敏感性，如白藜蘆醇在TMZ治療GBM中所發揮的協同效應是通過抑制自噬而產生的[23]。在Vu等[24]的研究利用CRISPR/Cas9將GBM的腫瘤細胞產生自噬小體所必需的自噬相關蛋白5基因剔除，結果發現，這種剔除只對自噬產生抑制作用，并未改變腫瘤細胞對TMZ的敏感性，同時也未發現TMZ可以誘導自噬。而有研究指出，TMZ可以通過誘導自噬性死亡殺傷GBM腫瘤細胞[23]，Vu等[24]推測這種結果可能是腫瘤細胞變異所導致的。

另有研究表明，抑制GBM腫瘤細胞線粒體自噬后可以提高TMZ敏感性，增強TMZ的細胞毒性[26]。Lohitesh等[27]發現，TMZ誘導的自噬使GBM細胞中保護性ATP大量增加，這種變化有利于腫瘤細胞抵抗TMZ的毒性作用，而促進耐藥的形成。這也從側面說明抑制GBM自噬的發生可以抑制耐藥的形成。Filippi-Chiela等[28]的研究發現TMZ對GBM細胞造成的急性DNA損傷激活了AMP活化的蛋白激酶催化亞基/AMP活化的蛋白激酶-unc-51樣激酶1和促分裂原活化的蛋白激酶14通路，并持續下調Akt-磷脂酰肌醇-3-激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路，導致自噬的活化；自噬與衰老標志物的表達呈顯著負相關，在DNA損傷前通過抑制mTOR可以促進細胞衰老，在損傷后可以通過抑制自噬進而誘導細胞凋亡，提高TMZ的敏感性，更多地殺傷腫瘤細胞。此外，有研究發現，某些藥物可以通過抑制自噬而對TMZ產生特異性增敏作用，如Thioridazine，它抑制自噬后可以抑制與TMZ耐藥相關代謝通路的改變，而使GBM對TMZ的作用更敏感[29]。綜上，雖然自噬在GBM的TMZ耐藥過程中發揮了重要作用，但具體機制仍需要進一步的研究，為解決GBM的TMZ耐藥性難題提供新的視角。

3 GSCs與TMZ耐藥

3.1GSCs概況 GSCs是膠質瘤組織中存在的極少具有“干細胞特征”的細胞亞群，具有自我更新、不斷增殖等特性[30]。1992年，Reynolds等[31]首次提出，包括人在內的哺乳動物的膠質瘤中存在GSCs，隨后被眾多研究者證實。有學者報道，因膠質瘤病理類型和級別的不同，GSCs所占比例為0.3%～9.1%[32]。Kondo等[33]報道，C6膠質瘤細胞系中GSCs約占0.4%。還有研究發現，多形性GBM中GSCs所占的比例為0.5%～3%，而髓母細胞瘤中這一比例為0.5%～0.8%[34]。以上研究表明，GSCs的比例與腫瘤的病理類型和惡性程度密切相關，且各類型中GSCs所占比例存在較大的差異。目前認為，GSCs樣細胞是GBM的起源細胞之一，是GBM極為容易復發的重要原因，也是GBM對放化療產生耐受的主要根源，在GBM發生和發展過程中起重要作用。

3.2GSCs與TMZ耐藥 對于GSCs與GBM耐藥性的關系，學界普遍認為，GSCs的存在使GBM細胞對TMZ等藥物治療產生了耐藥性，從而導致治療效果不佳，但其中的機制還有待進一步闡明[35]。Auffinger等[30]認為，在經過TMZ等化療藥物的治療后，膠質瘤內部分腫瘤細胞會轉化為GSCs，而這一類細胞會體現出對化療藥物更強的耐藥性，影響治療效果。而Gong等[36]的研究發現，TMZ雖然可以導致神經干細胞死亡，但是對GSCs的作用較小，而這種作用與多重耐藥的ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白G2基因的表達相關；另外，在對ABC轉運蛋白超家族的研究中發現，這一類蛋白可以幫助腫瘤細胞將TMZ泵出細胞，從而產生耐藥性。ABC轉運蛋白家族成員中的ABCB1、ABCC1和ABCG2在CD133+細胞亞群中明顯高表達，提示其可能是GSCs耐藥性產生的一個重要機制[37]。Yu等[38]的研究聯合使用二甲雙胍和TMZ處理GSCs后發現，GSCs自我更新能力降低，同時對TMZ的敏感性增加，而Akt-mTOR通路活性的下調則部分解釋了其中的機制。體內研究發現，GSCs容易向腫瘤周邊的腦組織遷移和侵襲，手術并不能將這些侵入腫瘤周邊的GSCs全部清除，即使術后輔助放、化療等，最終仍難以將其全部殺滅，GSCs因此成為膠質瘤術后復發的“種子”細胞[39]。除上述因素外，前文提到的MGMT同樣在GSCs的TMZ耐藥性形成中發揮重要作用。研究發現，MGMT在CD133+細胞中高表達，而MGMT啟動子甲基化狀態在未分化和參與分化的GSCs中對TMZ的敏感性表現出很大的差異，說明MGMT可能通過某種機制參與了GSCs耐藥性的產生[40]。此外，HH(Hedgehog)/Gli1信號通路也參與這一過程，GSCs異常激活了HH/Gli1信號通路，環巴胺對該信號通路抑制后可以顯著降低MGMT的表達[41]，表明在GSCs水平上確實存在HH/Gli1信號通路的調控機制，該信號通路可以調控GSCs中MGMT的表達和TMZ耐藥，這為解決GSCs的TMZ耐藥和GBM高復發率提供了一個新的研究方向。

4 小 結

GBM是腦膠質瘤中惡性程度最高、最具侵襲性的一種，且極易復發，長期存活率極低，目前只能以手術切除，再輔以放化療。而GBM對一線化療藥物TMZ易產生耐藥，除了一部分先天對TMZ不敏感的腫瘤細胞，一些原本敏感的腫瘤細胞也會在化療過程中逐漸發生獲得性耐藥，這極大地影響術后化療的效果。在獲得性耐藥形成的過程中DNA損傷修復、細胞自噬、腫瘤干細胞等都發揮重要的作用。目前的研究雖然揭示了GBM治療過程中TMZ耐藥形成的許多調控過程，但還有更多的問題尚未解決。近年來單細胞組學、高通量蛋白質組學、代謝組學等多重組學研究的發展，將為TMZ耐藥機制的系統闡明提供極為有利的幫助。