兔膝骨性關節炎模型建立的現狀

何小華，鄭曉霞，黃艷妮，程艷玲

(山東省藥學科學院，濟南 250101)

骨性關節炎是臨床常見的一種退行性骨關節病變，系由于增齡、肥胖、慢性勞損、創傷、關節先天異常等因素引起，其主要病變為關節軟骨破壞、退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨質增生，好發于膝關節，以中老年人群多見，又稱退行性關節炎或老年性關節炎[1]。臨床表現以緩慢發展的關節疼痛、腫脹、壓痛、僵硬、關節活動功能障礙為主，嚴重者出現關節畸形[2]。骨性關節炎發病機制非常復雜，病因尚不明確，目前臨床主要以預防和對癥治療為主，沒有良好的治療措施[3-4]。通常采用動物模型(鼠、犬、兔、羊等)探索膝骨性關節炎的發病機制和防治方法。由于建立骨性關節炎模型形成的原因及發病機制不同,最終引起關節產生的病理變化程度不一致，因此理想的動物模型既要符合發病機制和特點，又要滿足特定的研究需要。基于兔的膝關節大，負重大，與人相近，且脾氣溫順有利于開展實驗操作，故選擇兔建立穩定、可靠、有效的關節炎動物模型是研究骨關節炎發病機制及防治的重要手段[5]。現就兔膝骨性關節炎建模情況進行綜述，以為不同研究目的選擇不同的建模方法提供參考。

1 自發性模型

自發性模型，即實驗動物在自然環境情況下自發產生病變，沒有經過任何人為設立因素處理或因基因突變形成的骨性關節炎動物模型，經過育種、繁衍使基因遺傳保留下來的模型，如C57黑鼠等[6]。研究發現,以高脂飼料喂養C57BL小鼠可縮短其關節退變時間，尤其是喂養動物性油脂飼料，其骨性關節炎發生率更高[7]。高浜顯泓和山本吉藏[8]動態觀察模型發現，60%的小鼠6個月出現Ⅰ度骨性關節炎表現，18個月全部小鼠出現Ⅰ度骨性關節炎變性，僅有18%出現Ⅱ度，9%出現Ⅲ度骨關節炎表現。由于不受其他因素的影響，因此可以排除因造模差異產生的誤差。采用自發性動物模型可以了解骨性關節炎的全過程，適合于發病機制及各種防治效果的比較研究，但采用此方法建立兔膝骨關節炎模型的文獻報道極為少見。

2 誘發性模型

2.1骨內高壓誘導法 骨內高壓膝骨性關節炎模型利用阻斷動物下肢主要靜脈的血液回流，造成膝關節周圍骨組織內壓力持續升高[9]。劉蜀彬等[10]通過阻斷20只大耳白兔的膝關節股骨干骺端髓內局部血液循環，發現股骨關節面上軟骨在術后16周出現明顯的退行性改變。張如明[11]將兔髂外靜脈和股靜脈結扎，阻斷髕骨回流靜脈后保留膝關節自由活動，術后30 d髕骨遠近端表面有編織狀骨形成，60 d股四頭肌腱和髕腱細胞轉化為軟骨細胞，90 d形成軟骨灶，出現典型髕骨關節骨性關節炎的表現，但未發現嚴重的骨性關節炎病變，可能原因為造模時間短。戴七一等[12]采用結扎割斷新西蘭兔右側臀部的臀下靜脈、股靜脈及大隱靜脈來阻斷血運，升高骨關節骨內高壓，術后第8周發現早中期膝關節骨性關節炎模型形成。吳并生等[13]采用結扎股靜脈保留股深靜脈向髂外靜脈回流的通路保持動靜脈存在一定的壓力差，打亂骨組織的血流動力學引起骨內壓升高，最終形成局部軟骨及骨組織病變，也可建立骨性關節模型。當阻斷膝關節局部血運時，股內外靜脈淤血引起關節周圍骨內高壓、組織缺氧，產生大量酸性代謝產物，關節滑液pH值下降，從而導致軟骨營養供應受限，加速軟骨的退行性改變，因此骨內壓和靜脈淤積在骨性關節炎發病過程中不可缺少，但并不是骨性關節炎的起始原因[14]。

阻遏關節局部血液循環可誘導骨內高壓產生，有效避免了手術的創傷及術后炎癥反應的影響，是篩選骨關節炎藥物防治和早期病理變化的良好模型，但造模時間周期長，造模成功率低，不適宜慢性損傷導致的骨關節炎發病機制的探討[15]。

2.2手術誘導法 由各種原因導致關節的穩定性發生改變，不穩定的關節在長期的活動中造成關節的退行性改變是產生骨性關節炎的發病原因之一。因此，通過切斷或破壞關節結構及其附屬結構造成關節不穩可建立理想的動物骨關節炎模型。

2.2.1內側副韌帶和(或)髕韌帶切除 膝內側副韌帶和(或)髕韌帶具有穩定和運動膝關節的作用。多種原因導致膝內側副韌帶和(或)髕韌帶的損傷均可影響膝關節功能的穩定性，從而導致關節炎的發生。朱鴻飛等[16]將16只新西蘭大白兔切斷雙后肢膝內側髕韌帶2/3建模，術后1周每天強迫活動1 h，結果顯示術后6周、8周均出現關節軟骨細胞退行性改變及滑膜增生等，6周表現為膝關節炎早期改變，8周表現為膝關節炎中期改變。汪青春等[17]切除兔后肢髕韌帶3～4 mm發現,其可導致不同程度的膝骨性關節炎發生。楊松濱等[18]采用切斷兔內側副韌帶并切除部分髕韌帶建模，術后4、8周關節軟骨均有不同程度退變，此方法造成的軟骨破壞和滑液炎癥及修復過程與自然發生的骨性關節炎類似，但8周Mankin評分和白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α水平明顯升高，表明切斷內側副韌帶并切除部分髕韌帶的方法可以建立比較理想的兔膝骨性關節炎模型。

2.2.2前交叉韌帶和(或)半月板切除 關節不穩是導致骨性關節炎發生的原因之一，即通過改變關節結構導致關節應力發生變化，從而使局部受力不均會造成關節的退行性改變。江捍平和王大平[6]通過剪斷犬膝關節前交叉韌帶建模，觀察到膝關節炎發生過程與自然發生(前交叉韌帶破裂引起)類似，且病理改變相同。朱長謀等[19]將8只兔剪斷一側前交叉韌帶，摘除內側半月板，術后8周可復制骨性關節炎。Moskowitz等[20]采取從兔膝關節內側打開關節腔，將關節內半月板部分切除，以減少關節運動的緩沖作用，增加關節面的摩擦，造成關節不穩，從而建立穩定的骨關節炎模型。楊瑞甫等[21]從兔膝關節內側剪開部分關節囊，將兔膝關節前交叉韌帶完全切斷，避免損傷關節軟骨及后交叉韌帶，在術后6周出現軟骨中度損傷的表現，可獲得類似骨關節炎早期或中期病變，適合發病機制、藥物治療等方面的研究。

2.2.3Hulth模型 Hulth模型為最常用的經典模型，但其手術操作復雜，對實驗者技術、解剖結構熟悉程度要求較高，手術易損傷軟骨，影響實驗結果，造模后動物感染和死亡率較高，不適合早中期軟骨損傷的探討。造模的具體步驟是在無菌條件下從膝關節內側打開關節腔，切斷前后交叉韌帶，內側副韌帶及全部內側半月板，但保留關節軟骨面，術后不固定，自由活動。方銳等[22]在兔膝關節行Hulth法造模，術后4周可出現膝骨性關節炎的病理改變。蘇達明等[23]采用經典的Hulth法建立動物模型，術后第6周X線提示兔膝骨性關節炎造模成功。王君等[24]將兔右側膝關節前交叉韌帶切斷建立前交叉韌帶剪斷模型，3 d后將左腿石膏固定于腹部，右腿負重訓練，4周后發現兔膝關節負重模型可加快關節退行性改變，減少前交叉韌帶剪斷造模所需時間。這兩種方法均造成關節軟骨和軟骨下骨破壞，骨質增生，骨小梁紊亂，造模成功率高,具有一定的代表性，但前者關節軟骨易破壞且易出血、感染風險大，后者對預防或減輕骨關節炎發生發展的藥物研究尤為適用。

2.2.4關節應力改變誘導模型 骨關節面承受不同的應力均可導致關節面軟骨不同程度的退行性改變。低應力最早可引起早期軟骨細胞功能衰退，軟骨細胞出現輕度增生，最終出現關節軟骨破壞，骨質增生等退行性改變；高應力起初引起軟骨基質早期損傷，同時出現軟骨細胞代償性增生，軟骨破壞，從而導致關節軟骨退行性改變，其中在軟骨退行性改變中細胞因子發揮重要作用[25]。王勝等[26]通過延長兔髕韌帶3 mm，減少骨關節應力而造成髕骨軟骨退變，術后16周發現軟骨層變薄，出現縱行裂紋，細胞排列紊亂，軟骨下組織明顯疏松，表明降低關節軟骨壓力是引起退變的原因之一。陳寶興和丁繼華[27]將1周內的Wistar種大鼠結扎雙前肢和尾部，增加雙后肢關節應力，3、6個月分別處死剖檢，發現后肢股骨頭軟骨基質內假性囊腫形成，軟骨下骨出現退行性改變，此法可建立最理想的骨關節炎模型。可見，提高關節應力是引起關節病變的原因。

2.2.5軟骨劃痕誘導法 采用膝關節軟骨損傷建立動物模骨關節炎型能觀察膝關節退行性改變的演變和修復過程。利用銳器在關節股骨負重區軟骨上劃痕，深度不傷及軟骨下層，可以避免關節不穩定及滑膜炎癥影響關節軟骨保護和修復的治療效果觀察，但兔膝關節內劃痕極易造成滑膜損傷[28]。李釗等[29]采用小針刀在兔脛骨平臺和股骨髁軟骨表面上劃4～5道痕，深度不超過軟骨層，避免半月板和滑膜損傷，術后2 d開始活動，每天半小時，5周后發現關節軟骨出現退行性改變及骨關節炎的典型病理改變。Marijnissen等[30-31]采用刀片在犬膝關節股骨髁上劃傷，深度至軟骨，不超過軟骨下骨，術后對側肢體固定進行強迫運動，每周3 d，每日4 h，共20周。結果顯示，20周和40周(后20周松解對側肢體固定)后，發現關節軟骨的生化改變與臨床相同，但膝關節炎臨床癥狀輕微。因此，軟骨劃痕誘導法適用于關節炎早期軟骨保護和修復的治療措施效果的探索研究[32]，此法要求實驗技術人員對動物膝關節局部解剖結構非常清晰，操作手法需非常嫻熟，但手術劃傷深度掌控比較困難，因此造模成功率不高，未被廣泛推薦應用。

手術誘導法建模時間短，穩固性強，目前應用最常見的包括前交叉韌帶剪斷、半月板切除、內側副韌帶剪斷以及Hulth法、直立負重法等，但由于手術損傷大，易造成滑膜、軟骨的損失，切口感染、關節腔積液、關節腫脹，影響關節生化代謝和關節寬度測量指標的準確性，有的甚至死亡，因此不適合骨關節炎生化代謝藥物影響的探討[15]。然而，單純剪斷前叉韌帶并石膏固定1周，1周后強迫訓練，可有效避免手術操作造成的影響，同時也避免了長時間關節制動誘導造模的不利因素，適用于探討骨關節炎早中期病理改變及中醫藥療法的作用機制。

2.3腔內藥物注射誘導法 腔內藥物注射誘導法雖然創傷小，但要求操作者關節腔注射技術極為嫻熟，避免血管損傷及藥物注射造成實驗效果的誤差，而且腔內注射的藥物還直接影響關節生化代謝，不適用于需要測定生化指標的研究，主要用于軟骨病理及關節炎藥物預防和治療的研究。

2.3.1木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶，又稱木瓜孝素。其作用機制是降解軟骨內蛋白多糖和軟骨細胞膜上有絲分裂抑制因子，從而破壞軟骨蛋白水結合功能[33]。采用關節腔內注射木瓜蛋白酶模型的特點為軟骨退變快、模型可重復性好、穩定、造模時間短等，該模型骨性關節炎病變與人類骨性關節炎相同[34-36]。該模型適用于軟骨晚期病理、外用藥物治療及方法療效的研究[37]。韓冠英等[38]分別在第 1、3、5 天將不同濃度的木瓜蛋白酶(2%、5%、10%)注射入兔膝關節腔，首次注射后第2、4、6周出現膝骨性關節炎退行性改變，程度隨木瓜蛋白酶濃度升高而增加，隨著時間延長而發展。

2.3.2膠原酶 膠原酶是一種分解細胞間質的金屬蛋白酶。Kikuchi等[39]在兔膝關節腔內注射膠原酶，6周后，軟骨和滑膜出現退行性病理改變，膝關節上下關節面股骨髁和脛骨平臺邊緣病變尤為突出，且隨著時間延長，劑量增加，病變逐漸進展，與人類膝骨性關節炎表現極為相近。該實驗可在短時間內誘導骨關節炎癥反應，促進軟管退變，且所需劑量較木瓜蛋白酶低，造模較木瓜蛋白酶誘導更容易，是一種方便簡捷的造模方法，適用于骨性關節炎病理及治療骨關節炎藥物療效的研究。

2.3.3雌二醇 臨床上，膝骨性關節炎好發于肥胖絕經后女性，且雌激素分泌較多，提示雌激素與骨性關節炎發病有關。在實驗中發現關節腔內注射雌二醇可造成關節軟骨損傷，在兔的關節軟骨細胞內存在雌二醇受體，也說明雌二醇與骨性關節炎發生有關。Tsai和Liu[40]采用雌二醇注入兔膝關節腔，兔股骨髁關節軟骨9周后，表面變薄，軟骨面開裂，出現纖維化；12周侵襲破壞到軟骨鈣化層，股骨外露，電鏡顯示軟骨細胞不同程度的變形，細胞核凹陷，出現腔隙陷窩及囊泡，證實雌二醇與骨關節炎有關。

2.3.4菲律賓素 菲律賓素是一種從微生物中提取的抗生素，能破壞滑液中溶酶體，將其注入兔膝關節腔內，可誘導滑膜增生、基質破壞、關節周圍骨質增生、軟骨細胞破壞等退行性改變的發生，誘發膝骨性關節炎產生[41]。石輝等[42]用尿激酶型纖溶酶原激活物0.4 μg/0.2 mL注射關節腔，12周后可成功制備骨性關節炎模型。此外，腎上腺皮質激素、透明質酸酶、軟骨碎片、單體碘乙酸、異物等膝關節腔內注入也可以誘導膝關節軟骨的退行性病理改變[17，43-44]。劉伯齡和劉獻祥[45]研究認為，采用木瓜蛋白酶、膠原酶、雌二醇、聚乙烯亞胺等藥物關節腔內注射造模，因藥物分子量、劑量、注射時間不同引起關節軟骨退行性改變的程度不同。

2.4關節制動誘導法 長期固定動物后肢膝關節一段時間后可減少關節活動，改變關節應力，出現關節軟骨萎縮等退行性改變[17]。目前關節制動體位主要有伸直位、屈曲位和中間位等[3]。有研究將家兔膝關節固定30 d，關節軟骨表面有圓形凸起，但未完全破壞，而固定60 d后，關節軟骨退變不可逆轉[46-47]。Okazaki等[48]將家兔右后膝關節固定伸直位2周后，關節軟骨可見早期退行性改變，4周后可見中期退行性改變，6周后可見嚴重不可逆轉的退行性改變。關節制動誘導法可避免因手術引起滑膜損傷而影響模型的效果，更符合骨關節炎慢性損傷的病理演變，在研究關節炎藥物療效及藥物篩選方面具有明顯優勢，同時對關節軟骨成分及炎癥介質表達等具有重要意義[15]，但其固定松緊度不易掌握(松：沒有效果；緊：下肢出現淤血水腫、壞死、固定部位周圍皮膚磨損等)，造模周期長且長時間固定，下肢血液循環受阻，易導致踝關節和足周圍腫脹、潰破，出現壞死或感染，甚至出現新西蘭大白兔自噬下肢，嚴重者因下肢壞疽而死亡。

3 小 結

骨性關節炎是國內外專家學者研究的一個熱點，而有效建立合適穩定的動物模型，是研究骨關節炎發病機制、病理改變及防治的重要方法。因此，探索建立骨關節炎動物模型可為其防治提供一個良好的實驗基礎。目前建立兔骨關節炎模型主要采用關節骨內高壓誘導、關節內手術誘導、關節腔內藥物注射誘導、關節制動誘導、軟骨劃痕誘導等方法，各種誘導方法均有利弊，不同的實驗根據研究需要選擇適宜的建模方法，為順利完成動物實驗提供一定的參考依據。