光學分子影像導航下精準手術的應用與研究進展

王燕，方向明

(南京醫科大學附屬無錫人民醫院醫學影像科，江蘇 無錫 214023)

外科手術切除是惡性腫瘤最主要的治療方法。雖然術前CT、磁共振成像及正電子發射計算機斷層掃描等影像技術對病灶評估起重要作用，但由于時空差異性以及術中實地解剖與術前圖像存在顯著的差異，目前外科醫師在術中探測和切除腫瘤仍主要憑借其經驗，利用觸診和肉眼視覺完成病灶的識別與切除。腫瘤術后復發的主要原因之一是病灶殘留，如何精準發現病灶及界定腫瘤的邊界，既徹底切除腫瘤又盡可能保護正常組織結構，減少復發及術后并發癥是臨床手術面臨的巨大難題。

隨著醫學影像學的發展，術中影像導航技術有了很大發展，如術中磁共振成像及CT導航技術[1-2]已用于中樞神經系統腫瘤手術，但由于設備龐大、價格昂貴及輻射劑量大等缺點限制了其在臨床上的推廣。光學分子影像引導下的手術具備安全無創性及操作簡單等優勢，為術中導航提供了新的解決方法，可能開啟外科精準手術的時代。現就光學分子影像技術在術中導航的應用及研究進展進行綜述。

1 光學分子影像的概念與作用

分子影像是指通過二維或三維成像設備在分子和細胞水平上對生物過程的可視化、定性或定量分析[3-5]。近年來，分子影像技術成為研究的熱點，其中光學分子影像學是該領域中發展最快的方向之一。光學分子影像是利用自身的熒光物質的特性或外源性加入熒光化合物，在特定的光學成像設備下，將細胞行為轉化成可視化模式，提供更多的疾病信息，輔助醫師進行醫療決策。其作用可大致分為三類：①體內檢測，通常采用體外光學二維或三維成像設備，檢測活體內腫瘤或病變組織；②治療，多模態探針進入活體內，通過光學成像設備實時監測腫瘤組織，擔載的藥物用于腫瘤治療[6]；③術中導航，術前或術中注射熒光探針后，在光學分子影像系統的特定激發波下，熒光探針發射相應的波長，被熒光成像系統設備所接收，從而在顯示屏上清晰顯示出病變組織的形態，輔助醫師實現精準化手術。

2 用于術中導航的光學分子成像系統與探針

光學分子影像學的發展有兩個重要的方面：①對成像設備的改進，提高設備對其靶向物質的敏感性及特異性，使視野更加清晰化；②對分子成像探針的研究，開發具有更高敏感性與特異性的分子探針，提高靶向組織的顯影率，達到精準化目的。

2.1用于術中導航的光學分子成像系統 目前，熒光導航系統有Fluobeam (Fluoptics,Grenoble,Franc)[7]、PINPOINT Endoscopic Fluorescence Imaging System(Novadaq Technologies Inc,Bonita Springs,FL)[8]、D-Light P system(Karl Storz)[9]以及各實驗室自主研發的熒光影像設備[10]。其基本系統構成包括發射特定波長的激光器，接收熒光團發射的波長的接收器，通過圖像處理顯示熒光圖像的顯示器。

2.2用于術中導航的光學分子成像探針 光學分子成像探針根據功能的不同分為靶向型和智能型。靶向型探針又可分為主動靶向型探針和被動靶向型探針。主動靶向型探針即配體或抗體等物質與熒光分子以特定的方式結合后所構建的一種新的化合物，進入生物體內后，通過與靶點特異性結合從而顯影組織區域，如抗癌胚抗原抗體與熒光染料IR800所構建的主動靶向型探針在小鼠胰腺癌模型中有很好的定位作用[11]；被動靶向型探針則是利用類似于腫瘤的高通透性和滯留效應，使探針被動積聚在組織中。智能型探針指可響應組織中特定微環境(如活性氧類[12]、酸堿度[13]、酶[14])的改變，而發生熒光信號變化的分子成像探針。

構成熒光探針的必備物質是熒光成像劑，即具有熒光特性的物質。常用熒光成像劑有吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)、熒光素鈉、亞甲藍及其他近紅外熒光染料。ICG是應用最為廣泛的近紅外熒光染料，激發和發射波長分別為807、822 nm[15]，進入血液后，與血漿蛋白結合，主要由肝臟代謝。亞甲藍是小分子芳香雜環化合物，激發和發射波長為670、690 nm[15]，主要經腎臟代謝。5-ALA[16]是體內生成血紅素的前體物質，在特定波長(400～410 nm)的藍光照射下，代謝產物原卟啉物質可發出紅-紫熒光。熒光素鈉是一種有機熒光染料，在494 nm波長的激發下，發射512 nm波長，通常由于不完整的血腦屏障而積聚于腫瘤區域[17]。

3 光學分子影像導航手術的應用與研究

3.1腫瘤瘤灶的術中實時檢測、定位與分界 目前，術中外科醫師主要利用觸診及肉眼觀察評估病灶情況，如果腫瘤邊界與周圍組織分界清晰，則可進行完全切除，但色差超過人眼的分辨力或腫瘤呈浸潤生長則難以對腫瘤的邊界進行區分。在腫瘤切除時很大程度上依賴于經驗，為了最大限度地切除腫瘤，降低殘留及復發率，通常會選擇切除更多的瘤周正常組織(可能導致并發癥發生率的增加)或術中快速病理幫助檢測切緣有無殘留腫瘤組織(其耗時長增加麻醉不良反應的風險以及取材點不能覆蓋所有切緣面而存在著殘留及二次手術的風險)。為了尋求更精準的手術方式，光學分子影像引導下的手術逐漸進入臨床與臨床前研究。

3.1.1臨床應用研究 ICG已廣泛用于多種腫瘤手術。腹腔鏡肝癌手術中，利用ICG熒光融合影像技術可達到術中實時顯影腫瘤的效果，其檢測率達85%(45/53)，并且還能發現術前未能檢出的隱匿微小癌灶，清晰地顯影肝段的界限，實現解剖性肝切除，達到肝膽外科精準手術的目的[18]。乳腺癌手術中，超聲輔助下將ICG注射到病灶內，可實現術中實時顯影乳腺癌，并且清晰顯示腫瘤邊緣[19-20]。此外，在肺結節的臨床手術中，常規劑量(5 mg/kg)下，ICG最小可檢測出直徑為0.2 cm的結節，而在低劑量(1 mg/kg)下仍可顯影肺結節，通過提高熒光成像系統的敏感性，其結節檢出靈敏度高達88.7%(68/76)，但距離胸膜深度超過1.3 cm的結節，由于熒光穿透深度限制，未能顯示出熒光，產生假陰性的結果[21-23]。因此，綜合利用術前與術中的成像信息，多方面評估病灶的情況至關重要。

5-ALA及熒光素鈉主要應用于神經領域。患者經過5-ALA引導下的膠質瘤手術的術后中位生存時間及存活率均優于常規手術組，同時熒光組患者術后均未出現功能性的損害[24]。可見，5-ALA熒光導航下的切除手術有助于提高患者的預后，展示出熒光技術的優越性。利用熒光素鈉實施膠質瘤術中導航，同樣可以提高總切除率，減少復發[25]。鑒于5-ALA可以被惡性膠質瘤攝取，而熒光素鈉則主要積聚在血漿中，可以利用這一點充分發揮兩者熒光物質的特性，形成一種雙標記探針，尋求更精準的手術方式[26]。

除上述常用的熒光探針外，還有一些自主研發的熒光探針也逐漸進入臨床研究。通過葉酸標記的靶向型異硫氰酸熒光素熒光探針可精確定位卵巢癌及其轉移范圍，實現卵巢癌的精準手術[27]。之后，在高表達葉酸受體α的肺癌患者中，利用此類探針對界定腫瘤切緣展示出較好的效果[28]。在乳腺癌手術中使用γ谷氨酰羥甲基羅丹明綠探針可以清晰顯示腫瘤組織與正常組織的邊界，輔助外科醫師在保乳手術術中確定腫瘤切緣[29]。

3.1.2基礎研究 新型熒光探針的構建需要多種成分，各成分的安全性需要重新認證，需從有效性、安全性和倫理學等多角度進行評估，因此其作為藥物進入臨床需要很長的周期，這使得很多熒光術中導航的研究仍處于基礎研究階段。

整合素αvβ3可在多種腫瘤中高表達，形成有助于識別正常組織的特異標志物，是一種新型的抗癌治療靶點。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列能識別整合素αvβ3，并與之特異性結合。將介孔二氧化硅納米粒子修飾的ICG與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列相結合，合成的新型靶向型熒光探針ICG/介孔二氧化硅納米粒子-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列順利檢出直徑為1 mm的微小肝癌轉移灶[30]。結腸癌中，癌胚抗原通常呈現高水平，利用這一點，抗癌胚抗原抗體與DyLight 650熒光劑合成的靶向型探針可顯影結腸癌肝轉移小鼠中的癌灶，并且發現熒光組的無瘤生存期和總生存期均長于常規手術組，同時證明了熒光引導下的手術具有更大的應用前景[31]。

目前大多數臨床前研究是利用腫瘤細胞可以高表達某些物質(神經激肽-1受體[32]、前列腺干細胞抗原[33]、成纖維細胞激活蛋白[34]等)，而后合成相應的靶向型熒光探針進行實驗，這為光學分子影像導航手術的臨床應用打下了堅實的基礎。

3.2前哨淋巴結的檢出 臨床上，除關注腫瘤的檢出、定位及分界，前哨淋巴結的檢出同樣具有重要意義。前哨淋巴結通常是指腫瘤組織第一站所轉移的淋巴結。理論上若前哨淋巴結無轉移，則可避免進行淋巴結的清掃，縮短手術時間，降低手術風險的同時大大提高患者的生活質量。快速而又精準地檢出前哨淋巴結是臨床醫師所追求的目標。目前，臨床上檢出前哨淋巴結的方法有核素示蹤法、納米碳示蹤法和亞甲藍示蹤法，但存在輻射大、檢出率低等不足，ICG、5-ALA及其他熒光示蹤劑逐漸受到外科醫師的重視。

3.2.1臨床應用研究 乳腺癌患者中，應用ICG檢測前哨淋巴結探測率可達99%[35]，而聯合使用ICG與亞甲藍的檢出率均優于單獨使用ICG或亞甲藍[36]。充分利用不同熒光染料可提高該成像技術對前哨淋巴結的檢出效能。胃癌患者中，熒光素鈉對前哨淋巴結的顯影率高達95%(19/20)[37]，5-ALA的靈敏度和特異度分別為91.9%、90.8%[38]。此外，頭頸部[39]及盆腔[40]手術中使用熒光染料檢出前哨淋巴結的應用也均有報道。這些研究成果均表明光學分子影像技術在前哨淋巴結的檢出中具有很好的應用前景，可以輔助臨床醫師簡便而快速地檢出前哨淋巴結。

van den Berg等[41]報道的ICG-99Tcm的雙模態探針既可以術前利用正電子發射計算機斷層掃描對前哨淋巴結進行定位，又可以術中動態實時觀察前哨淋巴結，加上術中注射熒光素鈉，更加清晰地顯影淋巴管，這種雙模態探針增加了辨別前哨淋巴結的準確性，顯示了未來多模態探針發展的可行性。考慮到核素的輻射性，未來多模態探針應更多地往非輻射探針方向發展，如構建適用于磁共振成像與熒光導航系統的雙模態探針，術前利用磁共振成像評估腫瘤整體情況，術中使用熒光導航技術實時指導手術進程。

3.2.2基礎研究 關于前哨淋巴結的研究，已在頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、直腸癌及前列腺癌等展開多項試驗。為了減少熒光團淬滅，獲得性能更穩定的熒光探針，通過將納米凝膠與Cy7染料進行偶聯，得到尺寸僅為28 nm的熒光探針，納米尺寸的特性使其易于通過淋巴管引流至淋巴結，達到實時顯影的目的[42]。術中，檢出前哨淋巴結后仍需要通過快速病理判斷是否有轉移灶，若術中可實時評估淋巴結的狀態則可達到實時指導手術進程、縮短手術時間的目的。有研究表明，構建的巨噬細胞特異性的熒光探針可實現術中實時評估淋巴結狀態[43]。

3.3神經組織的保護 在外科手術中，對神經組織的保護尤為重要，一旦損傷神經會使其失去相應的支配功能，可導致聲音嘶啞、呼吸困難、肢體麻木、尿失禁等一系列并發癥。術中，外科醫師一般在肉眼下通過觀察組織的顏色及臨床經驗來區分神經與血管及其他組織，但是未充盈的血管及結締組織與神經顏色相近，容易出現判斷的誤差，對于細小的神經更增加了辨別的難度。目前，臨床上可通過神經監測儀來確定神經組織，但是流程復雜、需多個團隊的密切配合以及設備昂貴等不足，限制了神經檢測儀的臨床應用。而光學分子影像技術由于其獨特優勢，在神經顯影方面也有一定的應用。

3.3.1臨床應用研究 鑒于ICG固有的特性，目前神經顯影方面的臨床報道僅限于ICG這一種熒光染料。乳突切除術中，患者的面神經在注射ICG 1 min后即可顯影，醫師通過熒光精準尋找到神經，減少主觀盲目尋找神經的因素，從而降低神經損傷的風險[44]。同樣地，在保護胸交感神經的探究中，也有類似的臨床研究，術前24 h靜脈注射ICG后可在胸腔鏡手術中觀察到胸交感神經的顯影，相比以肋骨為解剖性標志來判斷胸神經節的位置，利用熒光顯影能清晰方便地直接識別神經組織[45]。神經束膜中的血流量可能會影響ICG的顯影效果。而束膜的血流量是不可控的，因此，如何嚴格掌控好ICG的劑量及熒光的拍攝時間等其他可控因素來提高顯影神經的效能需要進一步的實驗進行探究。

3.3.2基礎研究 神經顯影中主要報道的是噬菌體多肽與熒光物質構建成新型的熒光探針。該探針可清晰顯影小鼠的所有神經，并且已成功用于人體體外實驗[46]。在腮腺癌的動物模型中，也清楚可見面神經及其分支顯影，而且術后未發生神經功能的障礙[47]。此探針可以為術中保護神經組織提供很大幫助。但目前尚未正式進入臨床研究，需要更進一步的探索。目前，關于熒光顯影神經方面的報道較少見，這也為以后的光學分子影像研究提供了很大的空間，促使更多的學者研究這方面的相關內容，如尋求與神經結合的熒光靶向探針等。

4 小 結

光學分子影像導航手術正在臨床上展開一系列的研究，取得了一定的研究成果，但仍有很多問題需要進一步探究，如提高熒光探針的敏感性、安全性、靶向性以及改良熒光成像設備等。在保證熒光探針安全性的同時，加速基礎研究向臨床應用的轉化，讓更多的患者受益。對于目前一些醫院進行的單中心、小樣本的臨床研究，應進一步展開一系列的隨機、多中心、雙盲臨床試驗，以驗證其臨床應用效能。