胎盤間充質干細胞治療卵巢早衰的機制

楊稍稍，王焱，申倩倩，楊雪，王香香

(1.河南科技大學臨床醫學院，河南 洛陽 471000；2.河南科技大學第一附屬醫院婦產科，河南 洛陽 471003)

卵巢早衰是一種因卵巢功能減退引發的生殖系統內分泌疾病，其特征為血清雌激素水平下降、促性腺激素水平升高，多發生于女性初潮以后至40歲前。近年來卵巢早衰的發病率呈逐年升高趨勢，在15～29歲、30～40歲女性中的發病率分別為0.1%、1%～3%[1-2]，其不同程度地影響了患者的身心健康。目前超過50%的卵巢早衰患者的病因不明，其發生主要與自身免疫功能、代謝紊亂、遺傳和抗腫瘤治療等相關[3-4]。針對這些病因，對卵巢早衰進行早干預、早治療非常重要。目前臨床上的治療大多以改善癥狀為主，治標不治本，并未真正從根本上解決卵巢功能受損的問題，且遠期并發癥也較多。

隨著干細胞治療的興起，尤其是對胎盤干細胞研究的深入，給多種難治性疾病的治療帶來希望。胎盤間充質干細胞(placental mesenchymal stem cells，PMSC)是一種多能干細胞，不僅具有較強的增殖能力和多向分化潛能，還具有獨特的低免疫原性的特點。PMSC取材廣泛便利，不具有侵襲性，病毒轉染率低，無社會倫理爭議，因此得到了廣泛而深入的研究。目前，PMSC已廣泛用于自身免疫性或化療性卵巢早衰動物模型的研究，用以改善受損的卵巢功能。現就PMSC在自身免疫性和化療藥物引起的卵巢早衰中的研究進展進行闡述，以期為卵巢早衰的治療提供新思路。

1 PMSC與自身免疫性卵巢早衰

據報道，10%～30%的卵巢早衰可能有自身免疫機制的參與，通過體液免疫、細胞免疫攻擊卵巢組織，導致卵巢萎縮或卵泡衰竭[5-6]。Ebrahimi和Akbari Asbagh[7]研究顯示，卵巢早衰的病因與顆粒細胞的凋亡密切相關。卵巢內各級卵泡的發育依賴于顆粒細胞的增殖和分化，顆粒細胞能夠分泌類固醇激素和影響卵泡發育、閉鎖的細胞因子，如轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β、γ干擾素、表皮生長因子等。顆粒細胞的凋亡可能導致卵泡數量減少，雌激素水平降低，最終導致卵巢早衰[8]。有研究表明，PMSC植入卵巢受損區域后可調控多種信號通路，分泌多種細胞因子，調節免疫功能[9-10]，抑制顆粒細胞凋亡，減慢卵泡閉鎖過程，促進卵泡發育，改善卵巢組織內微環境，恢復卵巢的內分泌功能和排卵功能，提高生育能力[11]。PMSC治療卵巢早衰可能與調控顆粒細胞的凋亡有關。

1.1PMSC通過免疫調節調控顆粒細胞的凋亡 自身免疫性卵巢早衰患者體內可能存在抗卵巢自身抗體，這些抗體與抗原結合后在補體的協同作用下產生細胞毒性作用，加速卵巢衰竭過程，導致卵巢早衰[12]。透明帶是自身免疫性卵巢早衰患者體內重要的抗原決定簇，其中抗透明帶抗體能夠影響透明帶功能，繼而影響卵泡發育，導致卵巢早衰患者不孕。Zhang等[13]研究報道，PMSC移植可明顯改善透明帶糖蛋白3誘導的卵巢早衰小鼠體內的激素水平，提高卵巢儲備能力。這可能因為PMSC分泌多種細胞因子，通過TGF-β/Smad信號通路減少竇前卵泡和囊狀卵泡中顆粒細胞的凋亡，上調抗苗勒管激素的表達，抑制原始卵泡募集，減少原始卵泡消耗，提高卵巢儲備能力，從而恢復卵巢早衰患者的卵巢功能。

謝江燕等[14]研究發現，卵巢早衰患者外周血中調節性T細胞(regulatory T cell,Treg細胞)數量減少、TGF-β1的水平降低，γ干擾素水平升高，說明卵巢早衰可能與Treg細胞、TGF-β1、γ干擾素相關。TGF-β在卵巢功能的調節中發揮著至關重要的作用[15]，TGF-β1參與了顆粒細胞的增殖、卵母細胞成熟及類固醇激素生成，而γ干擾素可以啟動卵泡閉鎖過程，刺激顆粒細胞中主要組織相容性復合體Ⅰ和主要組織相容性復合體Ⅱ表達，導致卵泡破壞，過高水平的γ干擾素會抑制排卵[16]。Yin等[17]研究發現，PMSC可上調卵巢早衰小鼠血清TGF-β水平，降低γ干擾素水平，促進Treg細胞增殖，減少顆粒細胞凋亡，恢復卵巢功能。該研究認為，PMSC移植后能夠降低血清γ干擾素的水平，明顯阻斷卵泡閉鎖、破壞，減少各級卵泡中顆粒細胞的凋亡；PMSC通過分泌TGF-β，不僅在卵泡生成早期階段發揮刺激作用、調節原始卵泡池，還能刺激Treg細胞增殖，減少顆粒細胞凋亡[17]。這可能是PMSC通過免疫調節調控顆粒細胞凋亡治療自身免疫性卵巢早衰的主要機制之一。

1.2PMSC通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路調控顆粒細胞凋亡 PI3K/Akt是細胞內重要的信號轉導通路。在卵泡發育及排卵過程中，PI3K/Akt信號通路起著舉足輕重的作用[18]，能夠調節卵母細胞生長、原始卵泡發育以及顆粒細胞增殖和分化,是細胞增殖和凋亡過程中最主要的信號轉導通路之一[19]。若PI3K/Akt信號通路異常，可能會導致原始卵泡發育缺陷,引起卵巢早衰。PI3K/Akt信號通路在自身免疫過程中發揮重要作用[20]。楊靜和梁嘉麗[21]研究證實，卵巢早衰與PI3K/Akt信號通路密切相關，如果終止PI3K/Akt信號通路會導致原始卵泡過早發育,凋亡加速,最終導致卵巢早衰。馬會明等[22]研究指出，顆粒細胞分泌的表皮生長因子能夠刺激Akt，激活PI3K/Akt信號通路，抑制細胞凋亡，促進顆粒細胞增殖并持續分泌表皮生長因子，這種循環調節能夠促進卵巢功能的恢復。Yin等[23]研究發現，與PMSC移植小鼠相比，在透明帶糖蛋白3誘導的自身免疫性卵巢早衰小鼠中，使用LY294002阻斷劑阻斷PI3K/Akt途徑后，抗苗勒管激素和雌二醇的水平降低，卵泡雌激素、促黃體生成素和抗透明帶抗體的水平升高，卵巢組織中功能性卵泡數量明顯減少，顆粒細胞增殖減少、凋亡增加。以上研究表明，PI3K/Akt信號通路在PMSC移植小鼠卵巢功能的恢復中起重要作用。此外研究還發現，當LY294002阻斷PI3K/Akt通路后，小鼠中輔助性T細胞(helper T cell,Th細胞)/細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell,Tc細胞)比例顯著增加，Treg細胞減少，Th17/Treg細胞失衡，不能維持正常狀態下的免疫平衡，導致自身免疫的低耐受性和卵巢早衰進展[23]。PMSC的植入可能會影響免疫細胞并促進卵巢功能恢復，其機制可能為：PMSC移植后，激活PI3K/Akt信號通路，減少卵巢早衰小鼠卵巢中顆粒細胞的凋亡，降低Th17/Tc17細胞和Th17/Treg細胞的比例，從而改善卵巢功能。

1.3PMSC通過抑制肌醇需求酶(inositol-requiring enzyme，IRE)1α信號通路調控顆粒細胞凋亡 內質網應激是誘導細胞凋亡的信號轉導途徑之一[24]，參與卵巢功能的異常調節[25]。內質網是加工和合成細胞蛋白的重要細胞器，可維持細胞內環境的穩定。研究表明，顆粒細胞的正常生理功能取決于內質網中Ca2+儲存的穩態平衡[26]。一旦發生內質網應激，將會聚集大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質，Ca2+穩態失衡，細胞內環境穩態遭到破壞。此外內質網應激期間，胱天蛋白酶(caspase)12激活后調控顆粒細胞的凋亡。

IRE1蛋白是一個定位于內質網上的絲氨酸/蘇氨酸激酶/核酸內切酶，是內質網應激信號中最為保守的感應蛋白。IRE1α是一種能夠調節細胞命運的內質網跨膜傳感器，能啟動轉錄因子X-box結合蛋白1以調節內質網應激反應基因(如葡萄糖調節蛋白78)，通過減少未折疊或錯誤折疊蛋白恢復細胞穩態[27]。IRE1α過度激活，可通過激活下游信號分子增強子結合蛋白同源蛋白減弱自身免疫耐受性并誘導細胞凋亡[28]。增強子結合蛋白同源蛋白作為雌激素受體誘導細胞凋亡的重要介質，能夠增加凋亡誘導底物BIM的表達，同時減少B細胞淋巴瘤/白血病-2的表達[29]。Li等[30]研究發現，卵巢早衰小鼠卵巢組織中caspase-12的表達顯著增加，PMSC移植后，卵巢中IRE1α、X盒結合蛋白1、葡萄糖調節蛋白78以及caspase-12蛋白的表達被顯著抑制，從而導致顆粒細胞凋亡減少。以上研究表明，內質網應激相關的IRE1α信號通路在卵巢顆粒細胞凋亡中發揮重要作用。

2 PMSC與化療性卵巢早衰

目前關于化療性卵巢早衰的相關機制尚未闡明。研究認為，化療藥物導致的卵巢早衰可能與細胞內線粒體氧化應激及卵巢周圍組織血供密切相關[31]。PMSC移植入卵巢受損區域后，可通過某種信號通路、細胞因子、基因調控來改善線粒體功能，恢復受損卵巢組織血供，改善卵巢功能。

2.1PMSC與線粒體氧化應激 線粒體是顆粒細胞和卵母細胞中含量最豐富的細胞器。佟超[32]研究發現，線粒體異常是引起卵巢早衰的關鍵。活性氧類(reactive oxygen species,ROS)是線粒體的代謝產物之一，細胞內ROS水平及其合成速度對線粒體的代謝和生長至關重要[33]。Lin等[34]報道，銅鋅超氧化物歧化酶1通過調控細胞內超氧陰離子自由基和過氧化氫的穩態平衡，清除細胞內多余的ROS。Dando等[35]研究發現，線粒體膜上的解偶聯蛋白-2發揮著調節線粒體膜電位和ROS生成的作用。在相麗等[36]的研究中，環磷酰胺處理的卵巢早衰大鼠體內會產生大量的ROS，進而產生氧化應激反應，導致細胞線粒體功能受損，并誘發DNA/RNA損傷，引起卵巢組織內ROS和8-羥基脫氧鳥苷水平顯著升高，這種DNA改變與氧化應激間的惡性循環引起線粒體功能進一步減退，導致細胞內能量代謝降低有關。PMSC移植后可明顯降低環磷酰胺卵巢早衰大鼠體內解偶聯蛋白-2、超氧化物歧化酶1、ROS、8-羥基脫氧鳥苷的水平，改善線粒體功能，抑制氧化應激，從而降低化療藥物對卵巢功能損傷的程度。該研究認為，PMSC治療化療性卵巢早衰的機制可能為解偶聯蛋白-2通過解偶聯作用使線粒體膜電位發生變化，控制線粒體ROS的合成，降低氧化應激對線粒體的損傷，最終保護卵巢線粒體的結構和功能[36]。

2.2PMSC通過介導沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)/過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α,PGC1α)/核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2)信號通路 SIRT1是哺乳動物SIRT2超蛋白家族成員之一，定位于細胞核內，可通過調節多種底物的去乙酰化參與氧化應激、衰老以及凋亡等多種生物學過程，參與多種疾病的發生發展[37]。研究表明，SIRT1的高表達能夠防止氧化應激對卵巢組織的損傷[38]。PGC1α是SIRT1的下游分子，當組織受到氧化應激損傷時，SIRT1的活性、PGC1α去乙酰化受到影響，機體組織的代謝發生障礙[39]。為防止氧化應激引起的不可逆損傷，需要細胞中的多種抗氧化系統的調節，其中Nrf2在細胞的抗氧化應激中起關鍵作用。正常情況下，Nrf2處于抑制狀態，一旦發生氧化應激，Nrf2通路被激活[39-40]，然后發生一系列抗氧化反應，降低氧化應激對機體組織的損傷[41-43]。侯巧妮等[44]的研究表明，PMSC移植后，化療藥物誘導的卵巢早衰小鼠中SIRT1和PGC1-α的表達及Nrf2核轉位增加。該研究認為，PMSC遷移至卵巢受損區域后通過激活卵巢組織中的SIRT1/PGC1α/Nrf2信號通路，保護機體免受氧化應激損傷，改善激素水平，提高卵巢儲備能力，降低卵巢組織纖維化水平，從而恢復卵巢功能[44]。

2.3PMSC介導Bcl-2/Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)基因調控顆粒細胞凋亡 線粒體凋亡途徑主要受Bcl-2家族蛋白的調節,Bcl-2蛋白具有促進細胞生存，抑制細胞凋亡的作用，而Bax基因是Bcl-2基因家族的一員，其作用與Bcl-2相反，活化后能夠破壞線粒體膜的通透性，加速細胞凋亡。張純等[45]研究發現，Bcl-2/Bax的比值與卵巢顆粒細胞的凋亡相關，若Bcl-2蛋白含量降低，Bcl-2/Bax比值下降，細胞內線粒體的通透性增加，促使線粒體中細胞色素C和其他蛋白釋放，啟動一系列caspase凋亡級聯反應，促進顆粒細胞凋亡，反之抑制顆粒細胞凋亡。此外，PI3K/Akt信號通路激活后也可調節Bcl-2家族成員的活性,產生凋亡或抗凋亡的結果。楊陽等[46]研究發現，當內質網發生應激時，大量未折疊/錯誤折疊的蛋白質聚集，Ca2+超載或穩態失衡，一方面啟動caspase凋亡級聯反應；另一方面誘導Bax激活，下調Bcl-2蛋白的表達，促進凋亡發生。李永麗等[47]研究發現，卵巢早衰大鼠移植PMSC后，Bcl-2蛋白的表達增加，阻止線粒體細胞色素C釋放，抑制顆粒細胞凋亡，從而修復遭到破壞的各級卵泡，恢復卵巢組織結構，改善卵巢功能。

3 小 結

目前PMSC治療卵巢早衰雖然只在動物模型中成功，但仍給卵巢早衰患者帶來了希望。PMSC可通過PI3K/Akt信號通路調節免疫細胞，抑制顆粒細胞凋亡，改善卵巢組織微環境；也可通過抑制內質網應激中的IRE1α信號通路調控一系列細胞因子的表達，抑制顆粒細胞凋亡，從而治療自身免疫性卵巢早衰。對于化療性早衰，PMSC可能是通過SIRT1/PGC1α/Nrf2信號通路降低顆粒細胞和卵母細胞中的線粒體氧化應激反應，改善線粒體功能，從而改善卵巢功能；也可能通過調控Bcl-2/Bax比值改變線粒體膜通透性來調控顆粒細胞的凋亡，進而發揮治療卵巢早衰的作用。無論是自身免疫性還是化療性卵巢早衰，PMSC移植后可能通過相同的信號通路或線粒體途徑調控顆粒細胞的凋亡，使受損的卵巢功能恢復，這為臨床治療卵巢早衰提供了新思路，但目前仍需進行大量的臨床試驗進一步探討PMSC治療人卵巢早衰的可能性。