鹿角壯骨膠囊對膝骨關節炎兔血清及軟骨IL-6、MMP-3的影響

梁子聰 王恒 胡先運 江勇 胡建山 陸瑞娜 劉運麟

摘要：目的? 探討鹿角壯骨膠囊對膝骨關節炎兔血清及軟骨IL-6、MMP-3的影響。方法? 采用木瓜蛋白酶右側膝關節腔內注射誘導建立兔膝骨關節炎模型，將24只長耳大白兔隨機分為正常組、模型組、治療組，每組8只。正常組和模型組給予蒸餾水灌胃，治療組給予鹿角壯骨膠囊灌胃，治療4周后采用ELISA法檢測血清IL-6、MMP-3的含量，免疫組化法檢測各組兔膝關節軟骨IL-6、MMP-3的表達。結果? 模型組、治療組血清IL-6、MMP-3水平高于正常組，治療組血清MMP-3水平低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組和治療組膝關節軟骨IL-6、MMP-3表達高于正常組，治療組IL-6、MMP-3低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? 鹿角壯骨膠囊可通過抑制IL-6、MMP-3等致炎因子的表達起到防治膝骨關節炎的作用。

關鍵詞：膝骨關節炎;鹿角壯骨膠囊;血清;白介素-6;金屬基質蛋白酶;關節軟骨

中圖分類號：R684.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.020

文章編號：1006-1959（2020）01-0061-03

Effects of Lujiao Zhuanggu Capsule on Serum and Cartilage IL-6 and MMP-3

in Rabbits with Knee Osteoarthritis

LIANG Zi-cong1，2，3，WANG Heng1，HU Xian-yun1，JIANG Yong2，HU Jian-shan2，3，LU Rui-na4，LIU Yun-lin4

（1.Department of Basic Medicine，Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China;

2.Department of Orthopaedics，Qiannanzhou Traditional Chinese Medicine Hospital，Duyun 558000，Guizhou，China;

3.Department of Traditional Chinese Medicine，Sandu Aishan Hospital，Sandu 558100，Guizhou，China;

4.Qiannanzhou People's Hospital/Department of Ultrasound，the First Affiliated Hospital of Qiannan Medical College，

Duyun 558000，Guizhou，China）

Abstract：Objective? To investigate the effects of Lujiao Zhuanggu Capsule on serum and cartilage IL-6 and MMP-3 in rabbits with knee osteoarthritis. Methods? The rabbit knee osteoarthritis model was induced by papain injection into the right knee joint cavity. 24 long-eared white rabbits were randomly divided into normal group， model group and treatment group， 8 in each group. The normal group and the model group were administrated with distilled water. The treatment group was administrated with Lujiao Zhuanggu Capsule. After 4 weeks of treatment， the levels of IL-6 and MMP-3 in serum were detected by ELISA. Expression of IL-6 and MMP-3. Results? The serum levels of IL-6 and MMP-3 in the model group and the treatment group were higher than those in the normal group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the serum MMP-3 levels in the treatment group were lower than the model group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression of IL-6 and MMP-3 in rabbit knee joint cartilage was higher in the model group and the treatment group than in the normal group，the difference was statistically significant（P<0.05）; IL-6 and MMP-3 in the treatment group were lower than the model group， the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion? Lujiao Zhuanggu Capsule can prevent knee osteoarthritis by inhibiting the expression of IL-6， MMP-3 and other inflammatory factors.

Key words：Knee osteoarthritis;Lujiao Zhuanggu Capsule;Serum;Interleukin-6;Metal matrix protease; Articular cartilage

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種好發于中老年人的慢性退行性骨關節病，臨床以關節疼痛、腫脹、僵硬為主要癥狀[1]。KOA發病機制十分復雜，目前研究認為KOA發病與遺傳、細胞因子、基質金屬酶蛋白酶（matrix metaloprotease，MMPs）降解反應、軟骨細胞凋亡等因素密切相關[2]。非甾體類抗炎藥雖然能改善患者臨床癥狀，但其引起的不良反應也給患者身體帶來嚴重的危害[3]。KOA屬于中醫中的“痹癥”范疇，中醫藥治療KOA有其獨特的優勢，不良反應少。鹿角壯骨膠囊是我院研制的中成藥制劑，具有補益肝腎、祛風散寒、強壯筋骨的作用，在治療KOA方面具有較好的療效。本研究主要探討鹿角壯骨膠囊對KOA模型兔血清及軟骨IL-6、MMP-3的影響，為鹿角壯骨膠囊治療KOA提供實驗支撐。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組? 選取普通級4月齡日本長耳白兔24只，均為雌兔，體質量（2.0±0.5）kg，由長沙天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0010。適應性飼養1周，分籠飼養，不限制飲食。按照隨機數字表法分為正常組、模型組、治療組，每組8只。

1.2儀器? ?JA10002型電子天平（上海精天）;DDIL-5型恒溫箱（上海安亭）;ASP300 S型全封閉式組織脫水機、RM2265型全自動輪轉式切片機、HI1210型攤片機、DM750型光學顯微鏡（德國Leica），MR-96A型酶標儀（深圳邁瑞）。

1.3藥品與試劑? 鹿角壯骨膠囊由黔南州中醫醫院制劑科提供（批準文號：黔藥制2013003號，規格：0.45 g/粒），木瓜蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司），IL-6、MMP-3 ELISA試劑盒（北京誠林生物科技有限公司），封閉液（武漢博士德生物工程有限公司），IL-6、MMP-3抗體（北京百奧思科生物醫學技術有限公司），通用型SP試劑盒、DAB顯色盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、脫鈣液由黔南州人民醫院病理科提供，其余試劑均為國產分析純。

1.4方法

1.4.1造模? 三組分別行腹腔注射麻醉后，右側膝關節備皮消毒。正常組注射0.5 ml滅菌注射用水。模型組與治療組分別用針尖在內側膝眼進針，確認進入膝關節腔，緩慢注射4%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml。各組被動屈伸右側膝關節20次，促進溶液在關節腔內均勻擴散。

1.4.2治療方法? 首次注射后第2周，治療組給予鹿角壯骨膠囊藥粉0.3 g/kg（參照成人和實驗動物等效劑量換算[4]），稱取體重的相應劑量，用蒸餾水稀釋成10 ml后灌胃，1次/d，連續給藥4周。正常組、模型組給予10 ml蒸餾水灌胃。

1.5觀察指標? 比較三組血清IL-6、MMP-3水平及其免疫組化表達。

1.5.1血清IL-6、MMP-3含量檢測? 末次給藥第2天，麻醉處死所有實驗動物。股動脈取血，以3000 r/min離心15 min，留取上清液，采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清中IL-6、MMP-3水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.2免疫組化表達? 二甲苯透明脫蠟，修復抗原，PBS沖洗。滴加一抗（稀釋濃度：IL-6、MMP-3為1∶200），洗去一抗，滴加二抗，滴加辣根酶標記，DAB顯色，復染，封片。光學顯微鏡下攝片觀察。每張切片攝取3個視野（×400）。運用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件分析，計算指標平均光密度值。

1.6統計學方法? 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理。采用Shapiro-Wilk法作正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時選擇Tamhane法進行分析。不符合正態分布時選擇秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1三組血清IL-6、MMP-3水平比較? 模型組、治療組兔血清IL-6、MMP-3水平高于正常組，治療組兔血清MMP-3水平低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2三組膝關節IL-6、MMP-3免疫組化表達比較? 模型組和治療組兔膝關節軟骨IL-6、MMP-3表達高于正常組，治療組IL-6、MMP-3低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2、圖2。

3討論

KOA在中醫學中有“膝痹”“鶴膝風”之稱。《素問·痹論》曰：“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝為著痹也……以冬遇此者為骨痹。”古代醫者強調KOA的發病是由于膝關節遭受了風、寒、濕三邪侵襲，導致人體下肢經絡血氣受阻，引起膝關節疼痛、腫脹、關節功能障礙等臨床癥狀[5]。當代醫家結合自身臨床經驗，提出了對痹癥病因病機新的理解。李西海等[6]認為，骨關節炎與創傷性關節炎雖同屬中醫學中“痹癥”范疇，但兩者應該區別對待，其中創傷性關節炎主要由外傷、外邪侵蝕等外因引起，而骨關節炎多發生于老年人，無明顯的外傷病史，往往是內因引起;KOA病機則為“本萎標痹”，肝腎虧虛是該病發病的核心病機，由于肝腎精血日漸不足，不能濡養筋骨，從而導致慢性肌肉萎縮以及關節活動不利，久而成痹。

現代醫學研究認為，KOA的病程離不開炎癥反應導致的關節滑膜增生、軟骨退變、骨質增生等病理變化。白細胞介素可通過促進各種MMPs的酶原合成、分泌和活性增強，加速基質蛋白多糖、層粘連蛋白等多種基質蛋白的降解[2]。MMPs家族能直接降解軟骨的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，導致關節軟骨纖維結構遭到破壞，彈性喪失，還能令細胞外基質分解，降低軟骨細胞的保護能力，引起軟骨細胞死亡[7]。本院自制的鹿角壯骨膠囊以鹿角膠為君藥，起到補益肝腎、填精益血、強筋壯骨之功;以骨碎補、黃芪、當歸、熟地黃為臣藥，起到增強君藥補益肝腎之功。蘇軍等[8]認為鹿角膠其取自鹿角，為血肉有情之品，主歸肝、腎經，具有補肝腎、益精血的功效，較植物類藥物更能發揮補益肝腎之功。有研究證實[9，10]，中藥骨碎補可調節Bax蛋白、Bcl-2蛋白及凋亡因子Caspase-3，從而起到抑制軟骨細胞凋亡的作用，而軟骨細胞的凋亡與Bax蛋白和Bcl-2蛋白的基因表達關系密切。Bax是促細胞凋亡基因，是抗細胞凋亡基因，兩者作用相反，Bcl-2基因大于Bax基因時，OA軟骨細胞的壽命相對延長。黃芪中有效成分包括黃芪多糖、黃芪甲苷等。黃芪多糖對炎癥模型細胞所釋放的炎癥因子IL-6的表達具有抑制作用[11];黃芪甲苷能通過上調ECM-receptor interaction信號通路，發揮拮抗軟骨細胞凋亡、降低ECM降解的作用，促使細胞分泌膠原，實現對軟骨細胞外基質的修復作用[12]。有研究表明[13]，當歸能抑制大鼠炎癥模型關節滑膜與血漿中致炎因子IL-6、MMP-3的表達。本研究結果顯示，模型組、治療組兔血清IL-6、MMP-3水平高于正常組，治療組兔血清MMP-3水平低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;模型組和治療組兔膝關節軟骨IL-6、MMP-3表達高于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）;治療組IL-6、MMP-3低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），說明鹿角壯骨膠囊可以降低兔膝關節血清MMP-3、IL-16的含量，有利于抑制滑膜炎癥，抑制軟骨細胞的凋亡、降低ECM的降解、促進Ⅱ型膠原的合成、提高蛋白黏多糖的表達。

綜上所述，鹿角壯骨膠囊可通過抑制IL-6、MMP-3致炎因子的表達起到防治KOA的作用。

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收稿日期：2019-11-05;修回日期：2019-11-15

編輯/杜帆