基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黃連治療糖尿病的作用機(jī)制研究

邱楊 張菁

摘要：目的? 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段研究黃連治療糖尿病的作用機(jī)制。方法? 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取黃連的有效成分以及作用靶點(diǎn)，與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中糖尿病的作用靶點(diǎn)取交集獲取黃連治療糖尿病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用 DAVID在線工具進(jìn)行GO功能分析及KEGG通路富集分析。結(jié)果? 黃連的活性成分有14個(gè)，關(guān)鍵有效成分有11個(gè)，治療糖尿病靶點(diǎn)137個(gè)。黃連主要活性成分作用的核心靶點(diǎn)為JUN、MAPK1、IL-6等靶基因，參與調(diào)控Insulin resistance，Regulation of lipolysis in adipocytes等多個(gè)信號(hào)通路。結(jié)論? 黃連能發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同治療糖尿病作用。

關(guān)鍵詞：黃連;糖尿病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

中圖分類號(hào)：R285? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.021

文章編號(hào)：1006-1959（2020）01-0064-04

Study on the Mechanism of Coptis Chinensis in Treating Diabetes Based on Network Pharmacology

QIU Yang，ZHANG Jing

（Department of Pharmacy，Run Run Shaw Hospital，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310016，Zhejiang，China）

Abstract：Objective? To study the action mechanism of Coptis chinensis in treating diabetes by network pharmacology. Methods? Obtain the active ingredients and action targets of Coptis chinensis from the TCMSP database， intersect with the action targets of diabetes in the GeneCards database to obtain the predicted targets of Coptis chinensis for treatment of diabetes， use Cytoscape software to construct a Chinese medicine compound-target network and the STRING database to construct a PPI network Use DAVID online tool for GO function analysis and KEGG pathway enrichment analysis. Results? There were 14 active ingredients in Coptis chinensis， 11 key active ingredients， and 137 targets for treating diabetes. The core targets of the active components of Coptis chinensis are target genes such as JUN， MAPK1， and IL-6， which participate in the regulation of multiple signaling pathways such as Insulin resistance， Regulation of lipolysis in adipocytes.Conclusion? Coptis chinensis can play a multi-target and multi-path synergistic effect in the treatment of diabetes.

Key words：Coptis chinensis;Diabetes;Network pharmacology

糖尿病（diabetes）是因胰島素產(chǎn)生絕對(duì)不足或相對(duì)不足而導(dǎo)致的一種代謝性疾病[1]。隨著人口老齡化的進(jìn)程，我國(guó)糖尿病患病率逐漸升高。截止2013年，我國(guó)18歲以上人群的糖尿病患病率已達(dá)10.4%[2]。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴癥”范疇，《本草綱目》及《太平圣惠方》等經(jīng)典古籍均記載了黃連有“止消渴”的功效[3]。近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃連不僅能促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖，還能改善2型糖尿病大鼠的腎臟損害[4，5]，但目前對(duì)于黃連治療糖尿病的具體分子機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科[6]。相對(duì)于傳統(tǒng)試驗(yàn)藥理學(xué)方法，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有全面、系統(tǒng)的特點(diǎn)，尤其適用于多種化學(xué)成分、多重靶點(diǎn)的傳統(tǒng)中藥作用機(jī)理的闡釋。本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選黃連有效成分，明確其作用靶點(diǎn)，并進(jìn)一步探索其治療糖尿病的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)? TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）[7]、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）、DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.5.1 軟件、R3.6.0軟件。

1.2黃連活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選? 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取黃連有效成分以及作用靶點(diǎn)，依據(jù)口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）和類藥性（Drug-likeness，DL）值（OB≥30%和 DL≥0.18）過(guò)濾篩選出符合條件的活性化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3黃連治療糖尿病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)選擇? 在 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)，將通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的黃連的作用靶點(diǎn)與從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的糖尿病靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，獲取黃連治療糖尿病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.4黃連調(diào)控糖尿病作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? Cytoscape3.5.1 是一種可視化軟件，能更直觀的分析藥物治療疾病的作用機(jī)制，其中節(jié)點(diǎn)（node）代表中藥所含藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)，邊（edge）展現(xiàn)了中藥成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。首先構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)靶點(diǎn)連接情況篩選出黃連作用于糖尿病的關(guān)鍵化合物。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選? STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)可以用來(lái)分析蛋白質(zhì)之間的相互作用[8]，將黃連治療糖尿病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為最高置信度（“highest confidence<0.900>”），隱藏離散靶點(diǎn)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到黃連作用于糖尿病的PPI網(wǎng)絡(luò)。最后利用R腳本對(duì)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的互作聯(lián)系進(jìn)行計(jì)數(shù)排序，輸出連線數(shù)最多的30個(gè)靶點(diǎn)基因即核心靶點(diǎn)，繪制成圖。

1.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析? DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)為大規(guī)模基因或蛋白提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，且能提供最顯著富集的生物學(xué)注釋[9]。將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶基因名修正為官方名稱“official gene symbol”，設(shè)定閾值P<0.05，進(jìn)行 GO生物過(guò)程富集分析和 KEGG 通路富集分析。

2結(jié)果

2.1活性成分篩選? 通過(guò)OB、DL值篩選共獲得黃連的14個(gè)活性成分，見(jiàn)表1。

2.2黃連調(diào)控糖尿病作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? 共獲得137個(gè)共同靶點(diǎn)基因，利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)共有149個(gè)節(jié)點(diǎn)（node），其中有效活性分子11個(gè)，共同靶點(diǎn)基因137個(gè)，疾病1個(gè)，348條邊（edge），見(jiàn)圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選? 將137個(gè)共同靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到黃連治療糖尿病靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，圖中發(fā)生蛋白互作的節(jié)點(diǎn)有137個(gè)，邊有317條，平均節(jié)點(diǎn)自由度為4.63，平均聚集系數(shù)為0.465。利用R腳本對(duì)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行節(jié)點(diǎn)連線計(jì)數(shù)并排序，獲得黃連治療糖尿病的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

2.4 GO富集分析? 在獲得上述共同靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，將靶點(diǎn)映射入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示，共同靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程主要集中在正向調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、細(xì)胞分裂、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程、血壓控制、細(xì)胞外隙、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜組成部分等方面;轉(zhuǎn)錄分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、血紅素結(jié)合、G蛋白耦聯(lián)乙酰膽堿受體活性、類固醇受體結(jié)合等方面， 見(jiàn)圖3。

2.5 KEGG分析? 將靶點(diǎn)映射入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路注釋分析，結(jié)果顯示與糖脂代謝直接相關(guān)的通路有Insulin resistance，Regulation of lipolysis in adipocytes，Adipocytokine signaling pathway，Type Ⅰ diabetes mellitus，TypeⅡ diabetes mellitus，Insulin signaling pathway。與心臟血管相關(guān)的通路有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，F(xiàn)luid shear stress and atherosclerosis，HIF-1 signaling pathway，VEGF signaling pathway。與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路有TNF signaling pathway，IL-17 signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，F(xiàn)ocal adhesion，Cytokine-cytokine receptor interaction，NF-kappa B signaling pathway，Chemokine signaling pathway。與增殖、凋亡相關(guān)的通路有Apoptosis，MAPK，p53 signaling pathway。輸出富集基因最多的20條通路見(jiàn)圖4。

3討論

中藥在治療糖尿病中積累了幾千年的理論和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，在治療糖尿病及其慢性并發(fā)癥中發(fā)揮著重要的作用。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，對(duì)黃連控制糖脂代謝、保護(hù)心臟血管、抑制炎癥反應(yīng)、抑制凋亡通路、促進(jìn)增殖的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的相互作用及調(diào)控網(wǎng)路進(jìn)行了系統(tǒng)的挖掘和分析。

本研究發(fā)現(xiàn)黃連中作用于糖尿病的活性成分有14個(gè)，其中靶點(diǎn)數(shù)最多的活性成分為黃酮類的槲皮素，作用于56個(gè)糖尿病靶點(diǎn)。槲皮素能有效降低糖尿病肥胖大鼠血糖和膽固醇、調(diào)節(jié)血脂紊亂，促進(jìn)糖尿病足傷口愈合，抑制促炎因子IL-6、TNF-α表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10表達(dá)，減少糖尿病難愈性傷口部位炎性反應(yīng)過(guò)度的現(xiàn)象從而促進(jìn)傷口愈合[10，11];還能作用于糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞，抑制其凋亡，延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展[12]。其他活性成分如生物堿類的黃連素被報(bào)道可以通過(guò)過(guò)抑制ERK1/2、p38 MAPK信號(hào)通路起到抑制血管鈣化[13]，保護(hù)心血管，改善脂質(zhì)代謝，保護(hù)糖尿病性脂肪肝[14];且在體外高糖環(huán)境下，促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖，保護(hù)糖尿病性視網(wǎng)膜損傷[15]。因此，黃連活性成分的作用靶點(diǎn)如IL-6、MAPK等均是糖尿病治療藥物的重要靶點(diǎn)，與本文預(yù)測(cè)的黃連作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果相吻合。

另外，大量研究表明[16，17]，糖尿病患者體內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）較正常人明顯升高，其與受體（RAGE）結(jié)合后促使ROS生成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活NF-kb，是糖尿病腎病的形成和進(jìn)展中非常重要的一環(huán)，也是糖尿病創(chuàng)面難愈合的重要機(jī)制。在本研究中AGES-RAGE通路是黃連治療糖尿病中富集到最顯著的信號(hào)通路，該通路可能是黃連治療糖尿病的重要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)黃連治療糖尿病的活性成分、作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)黃連主要通過(guò)JUN、MAPK、IL-6等基因發(fā)揮作用。另外，黃連的多種活性成分相輔相成，通過(guò)控制糖脂代謝、保護(hù)心臟血管、抑制炎癥反應(yīng)、抑制凋亡通路、促進(jìn)增殖的多條通路發(fā)揮保護(hù)作用。不僅直接調(diào)控血糖，減少胰島素抵抗，還能降低血脂、保護(hù)心臟血管，改善糖尿病眼部以及足部損傷等并發(fā)癥，在糖尿病發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮保護(hù)作用。

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收稿日期：2019-10-20;修回日期：2019-10-29

編輯/成森