小細胞肺癌中信號通路及蛋白相互作用網絡分析

王東梅 張展英

摘要：目的? 分析小細胞肺癌相關的信號通路，構建蛋白相互作用網絡，探究小細胞肺癌相關的關鍵基因。方法? 從cBioPortal數據庫下載110例小細胞肺癌患者臨床和全基因組測序數據，采用R軟件分析數據的基本信息，KEGG信號通路富集分析，構建蛋白質相互作用網絡。結果? 共收集110例小細胞肺癌患者，其中男性多于女性，大部分患者年齡在60歲及以上，且吸煙人數多于戒煙人數，吸煙患者的突變位點數（n=345.4）高于戒煙組（n=299.70），差異有統計學意義（P<0.05）;信號通路富集顯示，發生突變的基因主要與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關。蛋白相互作用網絡顯示，與小細胞肺癌相關的基因有10個，其中PIK3CG和ERBB4的度最大。結論? 小細胞肺癌與吸煙有關，且吸煙可引起基因突變位點數增多。小細胞肺癌與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關，與PIK3CG、ERBB4基因關系密切。

關鍵詞：小細胞肺癌;基因突變;信號通路;蛋白相互作用網絡

中圖分類號：R734.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.025

文章編號：1006-1959（2020）01-0081-04

Analysis of Signal Pathways and Protein Interaction Networks in Small Cell Lung Cancer

WANG Dong-mei1，ZHANG Zhan-ying2

（1.Shanghai Qiming Information Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200000，China;

2.MayerDiagnostic Products Co.，Ltd.，Shanghai 200000，China）

Abstract：Objective? To analyze the signaling pathways related to small cell lung cancer， construct a protein interaction network， and explore key genes related to small cell lung cancer. Methods? The clinical and whole-genome sequencing data of 110 small cell lung cancer patients were downloaded from the cBioPortal database. The basic information of the data was analyzed using R software， and the KEGG signal pathway enrichment analysis was performed to construct a protein interaction network. Results? A total of 110 small cell lung cancer patients were collected， including more men than women， most of whom were aged 60 years and over， and the number of smokers was more than the number of people who quit，the number of mutation sites （N=345.4） in smoking patients was higher than that in the smoking cessation group （N=299.70），the difference was statistically significant（P<0.05）. The enrichment of signaling pathways showed that the genes that mutated were mainly related to the Wnt signaling pathway and calcium adhesion Protein signaling pathway and nicotinic acetylcholine receptor signaling pathway are related. The protein interaction network showed that there were 10 genes related to small cell lung cancer， of which PIK3CG and ERBB4 had the highest degree.Conclusion? Small cell lung cancer is related to smoking， and smoking can increase the number of gene mutation sites. Small cell lung cancer is related to the Wnt signaling pathway， the cadherin signaling pathway， and the nicotinic acetylcholine receptor signaling pathway， and is closely related to the PIK3CG and ERBB4 genes.

Key words：Small cell lung cancer;Gene mutation;Signaling pathway;Protein interaction network

受生活環境、習慣和遺傳等因素的影響，肺癌的死亡人數不斷增加，目前已成為全球發病率和死亡率最高的癌癥之一。Torre LA等[1]報道，2012年全球新增肺癌患者約180萬，占癌癥總人數的12.9%，肺癌死亡人數約159萬，占癌癥總死亡人數的19.4%。在我國，肺癌的發病率和死亡率均居于惡性腫瘤之首，因此預防、治療肺癌成為亟需解決的問題。目前肺癌的發病機制尚未完全明確，大量資料表明，長期大量吸煙是肺癌的一個重要致病因素，吸煙可增加肺癌的發生風險。Dong J等[2]對肺癌新發易感位點與吸煙的交互作用研究發現，肺癌患者一些基因突變位點與吸煙量相關。García Campelo MR等[3]報道，Wnt信號通路作為細胞信號傳導系統之一，在肺癌的發生發展中起重要作用。本研究選擇cBioPortal數據庫中小細胞肺癌的臨床和全基因組測序數據，通過信號通路分析，構建蛋白質相互作用網絡，發現關鍵基因，旨在為發現小細胞肺癌的發病機理提供幫助，報道如下。

1材料與方法

1.1數據來源? 從cBioPortal數據庫（http：//www.cbioportal.org/）中獲取110例小細胞肺癌患者的臨床和基因測序數據。檢索式為（“Lung Cancer”） AND （NOT “MIXED CANCER TYPES”） AND （NOT “Lung Squamous Cell Carcinoma”） AND （NOT “Lung Adenocarcinoma”）AND （NOT “Non-Small Cell Lung Cancer”），獲得Small Cell Lung Cancer（CLCGP， Nat Genet 2012）、Small Cell Lung Cancer（Johns Hopkins， Nat Genet 2012），Small Cell Lung Cancer（U Cologne， Nature 2015）3個數據集。選擇臨床資料豐富（包含性別、年齡、吸煙等信息）的數據集作為研究對象：Small Cell Lung Cancer （U Cologne，Nature 2015）。

1.2方法? 采用R軟件對收集到的臨床數據進行整理和統計，獲得數據的基本特征。根據過濾條件對分子數據進行預處理，預處理規則如下：①根據Variant_Type類型，挑選SNP、INS、DEL三種變異類型;②保留編碼區變異位點，排除非編碼區域的變異位點;③排除熱點突變位點;④排除胚系變異位點。對基因進行Pathway的富集分析，由于Pathway的條目中包含很多條信號通路，且每個信號通路所包含基因的數目變化較大，采用Fisher精確檢驗計算P值（P<0.05），再通過多重比較檢驗，確定Pathway的FDR值。檢索KEGG數據庫獲得蛋白相互作用關系，導入Cytoscape v3.7.1軟件構建蛋白相互作用網絡，采用NetworkAnalyzer工具計算網絡的拓撲參數。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1數據基本情況? 共收集110例小細胞肺癌患者，其中男70例（63.64%），女40例（36.36%）。患者平均年齡為64.59歲，其中60歲及以上的共80例（72.73%）。吸煙53例（48.18%），戒煙42例（38.18%），無吸煙經歷2例（1.81%），吸煙狀態信息缺失13例（11.82%）。統計每個樣本的突變總數，去除離群值后，進行單因素的方差分析，結果顯示吸煙患者的突變位點數（n=345.4）高于戒煙組（n=299.70），差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 Pathway富集分析? 在吸煙（Current）和戒煙（Former）患者中，以超過10%的突變基因為研究對象，進行Pathway富集分析，結果顯示，發生突變的基因主要與Wnt信號通路（吸煙：P=6.48E-6，FDR=3.54E-4;戒煙：P=8.27E-9，FDR=1.36E-6）、鈣粘蛋白信號通路（吸煙：P=1.40E-5，FDR=5.73E-4;戒煙：P=9.70E-7，FDR=5.30E-5）、煙堿乙酰膽堿受體信號通路（吸煙：P=3.09E-5，FDR=1.01E-3;戒煙：P=2.59E-3，FDR=3.85E-2）有關，見圖1。

2.3蛋白質相互作用網絡? 以吸煙中超過10%的突變基因為研究對象，檢索KEGG數據庫中蛋白相互作用關系，構建蛋白相互作用網絡，見圖2。用NetworkAnalyzer工具計算網絡中的拓撲參數，結果顯示度大于10的基因有PIK3CG、ERBB4、NOTCH3、NOTCH1、MYLK、EP300、CREBBP、TP53、ARAF、GRM5、GRM1、ADCY8、GNAL、ADRBK2、GLI3、ARRB2、RB1，其中PIK3CG基因在網絡中度最大為83，ERBB4基因次之為36，且PIK3CG和ERBB4是網絡中介數中心性和緊密中心性最大的2個基因，見表1。

3討論

3.1小細胞肺癌的基本特征? Chen W等[4]研究顯示，中國肺癌患者中男性的發病率為69.45%，女性發病率為30.55%。本研究統計了小細胞肺癌患者的性別比例，發現男性患小細胞肺癌的比例高于女性，表明小細胞肺癌可能與性別有關。本研究中小細胞肺癌患者的平均年齡為64.59歲，且大部分為60歲及以上的老年人，表明小細胞肺癌最常見于60歲以上的老年人。吸煙人數占總人數的48.18%，戒煙人數占38.18%，有吸煙經歷的患者占86.36%，表明小細胞肺癌的發生與吸煙有關。這與Tonini G等[5]的研究結論一致，說明吸煙是肺癌的一個最重要的危險因素，其中87%的肺癌患者死亡與吸煙有關。同時，吸煙患者的基因突變位點數高于戒煙患者[6]，表明吸煙容易引起與癌癥相關的基因突變。

3.2 Pathway富集分析? 目前已有研究顯示，Wnt信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路與肺癌的發生密切相關。Wnt信號通路參與細胞的增殖、分化、運動及凋亡等過程，為細胞發育所需，調節細胞的行為及細胞的相互作用，Vaughan AE等[7]發現激活Wnt信號通路可增加腫瘤發生的概率。尼古丁對中樞神經系統的作用主要通過尼古丁乙酰膽堿受體實現，除中樞神經系統的神經元，全身許多細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞、脂肪細胞、角質細胞、內皮細胞及腸道和肺的上皮細胞均表達尼古丁乙酰膽堿受體。Schuller HM[8]研究表明，尼古丁及尼古丁乙酰膽堿受體在肺癌的發生、發展中起著重要的作用，包括調控細胞增殖、細胞凋亡、新生血管的形成等。本研究顯示，發生突變的基因主要與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關。Wnt信號通路主要通過3種途徑進行傳導：①經典Wnt信號途徑（Wnt/β-catenin信號通路），該通路激活后將募集細胞質內的β-catenin，隨后β-catenin進入細胞核內激活靶基因表達，而在沒有Wnt信號存在時，β-catenin則被APC-Axin-GSK3β-CK復合體泛素化降解，通路即關閉;②Wnt/PcR通路：主要作用可能是參與調控胚胎發育時期細胞骨架的重排;③Wnt/Ca2+ 途徑：該通路由Wnt-5a或Wnt-1l激活，活化后的CDK2和PKC使胞內鈣離子濃度升高，導致NFAT在核內蓄積誘導靶基因的表達。E-鈣粘蛋白是參與細胞間粘附連接的重要分子，發揮著維持細胞極性和組織結構完整性的功能，其主要通過與β-連環蛋白形成復合體介紹同質細胞之間的相互粘附抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲;同時E-鈣粘蛋白競爭性和β-連環蛋白結合，降低細胞內游離型β-連環蛋白水平，從而抑制其參與Wnt信號通路細胞增殖基因的表達。E-鈣粘蛋白復合體的異常可能會引起細胞之間的黏附能力減弱以及腫瘤細胞的運動能力增強，從而導致細胞容易脫離、侵襲和轉移。小細胞肺癌和非小細胞肺癌細胞系均存在尼古丁乙酰膽堿受體，目前發現尼古丁在肺癌細胞中的主要作用為促進腫瘤組織細胞增殖和抑制藥物誘導的細胞凋亡。

3.3蛋白相互作用網絡? 本研究構建的蛋白相互作用網絡中，度大于10的基因有PIK3CG、ERBB4、NOTCH3、NOTCH1、MYLK、EP300、CREBBP、TP53、ARAF、GRM5、GRM1、ADCY8、GNAL、ADRBK2、GLI3、ARRB2、RB1，提示這些基因可能與小細胞肺癌密切相關，其中PIK3CG，ERBB4是網絡中度最大的2個基因，表明PIK3CG和ERBB4基因在網絡中起重要的作用。這與很多研究的結論類似，如：PIK3CA基因編碼的蛋白是PI3Ks的催化亞單位，PI3Ks是一種脂激酶家族。PIK3CA基因的突變可以導致PI3Ks的催化活性異常增強，促使細胞發生癌變，其機制主要為PI3K/AKT通路是細胞信號傳導中一個重要通路，PI3Ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇的3位羥基，產生第二信使肌醇類物質如PIP3，PIP3可促使AKT轉移到細胞膜上并被PDK1/PDK2活化，AKT則是PI3K/AKT信號通路中核心因子，異常活化的AKT會導致腫瘤發生。Kurppa KJ等[10]發現在非小細胞肺癌中存在ERBB4致癌突變，該基因編碼的蛋白屬于表皮生長因子受體家族，該家族包括HER1、HER2、HER3及HER4，也屬于受體酪氨酸激酶家族。ERBB4可被neuregulins等蛋白激活，從而磷酸化下游蛋白，參與細胞的有絲分裂和分化，其突變與多種癌癥有關。Westhoff B等[13]在原代NSCLC上皮細胞培養過程中，發現Notch1基因突變的細胞被ν-分泌酶抑制劑選擇性地殺死，提示腫瘤細胞增殖的優勢依賴Notch信號。Notch基因編碼一類高度保守的細胞表面受體，這些受體調節多種細胞的發育，從而Notch信號影響細胞正常形態發生的多個過程，包括多能祖細胞的分化、細胞凋亡、細胞增殖及細胞邊界的形成。Fernandez-Cuesta L等[14]的研究表明，參與細胞周期調控的重要抑癌基因TP53是小細胞肺癌的特征性基因變異。TP53基因又稱為P53，是一種抑癌基因，該基因的異常與超過半數的腫瘤相關。p53還是一個轉錄因子，與很多靶基因有關，影響細胞凋亡或細胞周期的調控過程，比如編碼細胞周期依賴性蛋白激酶抑制蛋白的p21基因和凋亡前體蛋白BAX的編碼基因等。

綜上所述，本研究發現小細胞肺癌與吸煙有關，且吸煙會引起基因突變位點數量的增加。小細胞肺癌與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關，可能與PIK3CG、ERBB4基因密切相關。

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收稿日期：2019-09-02;修回日期：2019-10-24

編輯/錢洪飛