兒童支原體肺炎及重癥支原體肺炎外周血中TLR2、TLR4 的表達及意義

姚麗娜，王慶，王巧文，張俊玲

（華北理工大學附屬醫院兒科，河北 唐山）

0 引言

肺炎支原體是近幾十年來兒童常見的呼吸道感染病原，多見于社區獲得性感染，主要發生在兒童和青年成人[1]。近幾年，我國兒童的肺炎支原體病例數逐漸增加，占社區獲得性肺炎的10%-30%[2]，大環內酯類單一治療效果不佳，肺大葉實變，累計肺內、肺外系統的重癥支原體肺炎病例數逐漸增多，預后較差[3]。目前支原體肺炎的發病機制尚不清楚。國內外大量文獻指出，免疫機制在支原體感染肺部損害過程中發揮重要作用[4]。1996 年，Lemaitre 等人發現Toll 受體在成年果蠅先天免疫抗真菌感染機制中發揮重要作用，繼而Beutler 研究團隊在哺乳動物中亦檢測出相似的TLR4 受體，之后研究發現哺乳動物TLR3、TLR5 等受體[5]。Toll 樣受體（toll-likerceptors）位于前哨細胞（包括巨噬細胞和樹突狀細胞）[1]，是歸屬于模式識別受體（The pathogen recognition receptors）的大家族，連接先天及后天免疫[6]，其激活導致炎癥細胞因子、趨化因子、抗原呈遞分子和共刺激分子的誘導[7]。探索調控MP 致病的機制，可能為尋求治療支原體肺炎的新方法提供理論基礎和研究方向。本研究采用RT-PCR 方法檢測TLR-2、TLR-4mRNA 在支原體肺炎患兒外周血單核細胞中的相對表達量，旨在探討TOLL 樣受體在支原體感染過程中免疫介導的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

支原體肺炎組：病例選自2018 年11 月至2019 年3 月在唐山市婦幼保健院兒科住院的支原體肺炎患兒共114 例，其中男65 例，女49 例。平均年齡(3.72±0.89) 歲，所有病人入組均參照《諸福棠實用兒科學》第8 版中MPP 診斷標準。其中MPP 入組標準[8-10]：具備發熱、咳嗽、呼吸困難、肺部啰音等呼吸道表現，伴胸部影像學單側或雙側異常改變，并出現肺炎支原體特異性IgM 抗體陽性（采用微粒子凝集法，急性期滴度＞1：80 為陽性）。SMPP 組入組標準[11-12]：患兒除滿足MPP 診斷標準外，需滿足以下任意標準：①經大環內酯類藥物治療1 周后，仍高熱持續超過10d，且劇烈咳嗽；②影像學顯示單側或者雙側肺大葉高密度肺實變，或者雙側間質性彌漫性肺浸潤，胸腔大量積液，甚至壞死性肺炎；③炎癥指標C反應蛋白≥40mg/L，中性粒細胞百分數超出正常上限；④合并心肌、肝臟等臟器損害。健康對照組：選取同期我院兒保科體檢的50 例健康小兒為對照組，男30 例，女20 例，平均年齡(3.85±1.26)歲，無心臟、肝臟、腎臟以及腫瘤等嚴重疾病者；無先天性畸形者，近期無感染病史。

1.2 方法

1.2.1 采集SMPP 組患兒入院當天( 即急性期) 靜脈血2mL，普通MPP 組患兒入院當天(即急性期)靜脈血2mL，體檢時采集健康兒童外周血2mL，于-4℃冰箱保存。

1.2.2 于采集24 小時內水平梯度離心，吸取中間以淋巴細胞為主的云霧層。

1.2.3 采用TIANGEN 生產的微量樣品總RNA 提取試劑盒提取外周血中中性粒細胞及單核細胞中RNA，嚴格按照說明書的步驟進行。RNA 提取后，用紫外分光光度計檢測總RNA 濃度和純度，于-80℃冰箱保存。

1.2.4 每個樣本分別取RNA 5ug，采用TIANGEN 生產的逆轉錄試劑盒，嚴格按照說明書進行。再以第一鏈cDNA 2 為模板進行PCR。

1.2.5 采用RT-PCR 法來評估檢測患兒外周血中TLR2、4mRNA的相對表達量，在這項研究中使用的引物見表1。

1.3 統計學分析

實驗數據用SPSS 17.0 軟件進行統計學數據處理分析，計量資料采用均數±標準差表示，兩樣本均數比較用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 重癥支原體肺炎患兒熱程明顯長于普通支原體肺炎，差異有統計學意義（P＜0.05）；重癥支原體肺炎患兒住院時間明顯長于普通支原體肺炎組，差異有統計學意義；實驗數據：重癥支原體肺炎組患兒與普通支原體肺炎相比，C-反應蛋白明顯增高，血沉明顯增快，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 支原體肺炎組與健康體檢患兒組相比，外周血中TLR-2、TLR-4 mRNA 表達量明顯增多，差異有統計學意義，重癥支原體肺炎組外周血中TLR-2、TLR-4 mRNA 表達量明顯高于普通支原體肺炎組，差異有統計學意義。

表1 TLR2、 TLR4mRNA 引物序列

3 討論

近年來，國內外重癥及難治性肺炎支原體感染病例數逐漸增多，大環內酯類治療效果不佳的支原體肺炎患者病例數逐漸增多[13]。部分重癥支原體肺炎治療效果不佳，引起胸腔積液、肺不張，甚至累計全身多臟器的并發癥。支原體肺炎的感染致病機制近幾年在國內外研究中取得進展[14]。支原體是區別于細菌及病毒，在自然界獨立存在的病原微生物，研究顯示通過免疫介導的肺損傷目前認為主要是其致病機制[15]。TOLL 樣受體家族作為人體先天免疫的重要識別受體，是承接先天免疫及后天免疫的重要橋梁[16]。

國內外多項研究顯示，肺炎支原體感染患兒外周血中TLR2、TLR4mRNA 的相對表達量較健康對照組患兒明顯增多，重癥支原體肺炎組患兒較普通組支原體肺炎患兒相對表達量增多，本研究再次驗證了該觀點。為探尋重癥支原體肺炎的早期識別及治療的靶點提供新的思路。