細胞因子和缺氧誘導因子及微RNA對類風濕關節炎滑膜細胞的作用

徐凱捷，歐陽桂林

(1.上海中醫藥大學，上海 201203； 2.上海市光華中西醫結合醫院關節外科，上海 200052)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵襲性關節炎為主要表現的自身免疫性疾病，其特征為滑膜炎癥[1]。該病好發于手、腕、足等小關節，呈對稱分布，隨著疾病的進展，可逐漸擴散到腕踝、膝髖等關節，RA若不及時有效地進行治療，則可能損害關節、甚至導致殘疾。人體關節腔內關節囊覆蓋關節軟骨面，而關節囊可分為內層和外層，外層纖維層堅韌且厚、由致密結締組織組成，內層滑膜層薄而柔軟、由疏松結締組織組成，滑膜層可分泌滑膜液起潤滑營養、減少關節軟骨摩擦等作用。滑膜可分為滑膜襯里層和滑膜襯里下層，其中滑膜襯里層是RA中炎癥的主要部位[2]，常駐細胞為成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)和巨噬細胞樣滑膜細胞(macrophage-like synoviocytes，MLS)，而FLS為中心細胞，其通過促進滑膜炎、血管翳生長參與 RA的許多病理過程，最終導致軟骨和骨破壞。在類風濕炎癥中，FLS分泌各種促炎細胞因子，而細胞因子分泌可影響其他免疫細胞，特別是MLS與滑膜的相互作用，MLS可通過分泌活性氧類、一氧化氮中間體、基質降解酶等促進RA進展；此外，MLS在RA滑膜中產生不同種類的細胞因子，可通過募集其他免疫細胞并激活FLS來加速炎癥反應[3]。因此，FLS和MLS作為RA的關鍵影響因素，被越來越多的學者作為研究RA的主要靶向細胞，且以FLS為主。現就細胞因子、缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)和微RNA(microRNA，miRNA)對RA滑膜細胞的作用予以綜述。

1 細胞因子與滑膜細胞

在RA、系統性紅斑狼瘡、脊柱關節炎等風濕免疫疾病中，細胞因子是重要的信號分子，其通過特定受體介導細胞之間的通訊來協調免疫反應。細胞因子是一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白，其由免疫細胞或其他細胞經刺激而合成及分泌，RA滑膜細胞和滑膜組織中分泌多種細胞因子，這些細胞因子對免疫的調節不平衡，包括抗炎細胞因子產生的不足和促炎細胞因子產生的增加、兩者作用導致慢性炎性病癥[4]。其中，常見的細胞因子有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-17等。

1.1TNF-α TNF-α是TNF家族的成員，在介導炎癥反應及細胞死亡中起重要作用，被證明是RA炎癥的主要介質[5-6]。TNF-α主要由巨噬細胞、單核細胞等產生，最初作為跨膜蛋白合成，通過與以兩種不同形式存在的受體(TNF受體1和TNF受體2)結合而發揮作用[7]。研究表明，TNF-α刺激滑膜不僅能導致促炎細胞因子的表達和產生[8]，也可以刺激滑膜細胞及軟骨細胞合成前列腺素E2與膠原酶[9]。Zhang等[10]試驗發現，TNF-α可促進RA-FLS的增殖，并抑制程序性細胞死亡因子5的信使RNA轉錄和蛋白表達。呂邵娃等[11]經酶聯免疫吸附劑測定發現，與非TNF-α組相比，TNF-α組誘導FLS的炎癥因子IL-6和抗凋亡因子B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)水平顯著升高。Shibasaki等[12]采用蛋白質組學分析技術發現，TNF-α可誘導FLS內信號轉導及大量纖溶酶原激活物抑制劑2，而相關纖溶酶原激活物抑制劑主要分布在增生和浸潤性滑膜組織的滑膜襯里區域。可見，TNF-α對于滑膜細胞具有增殖和促炎作用，而阻斷TNF-α能夠改善滑膜炎癥，延緩關節的破壞，因此在臨床上使用TNF-α抑制劑具有較好療效[13]。

1.2IL-1 IL-1家族包含11個成員，其存在IL-1α、IL-1β兩種形式，IL-1可調節固有免疫和適應性免疫應答、涉及效應細胞的募集和活化，參與炎性腸病、RA等疾病[14-15]。同時由于IL-1在炎癥小體激活的下游起關鍵作用，故被認為是許多自發性疾病的致病性細胞因子[16-17]。研究發現，炎癥相關因子IL-1β和TNF-α可促進FLS增殖并產生IL-1α、IL-1β等，從而進一步加重滑膜炎癥反應[18]。Chen等[19]在實驗中使用IL-1β誘導炎癥，結果觀察到IL-1β刺激顯著增加RA-FLS的細胞活力，表明IL-1β能誘導FLS增殖。Tsai等[20]證實，與未刺激組相比，IL-1β刺激組誘導增加了滑膜細胞中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)1及促炎細胞因子(TNF-α和IL-6)的表達。可見，IL-1β在滑膜細胞的增殖、炎癥促進方面具有重要的調節作用。

1.3IL-6 IL-6是具有廣泛作用的炎癥細胞因子，RA-FLS可以自發分泌多種促炎細胞因子，如IL-6、IL-8以及MMP(MMP-1和MMP-3)，它們在關節的逐漸破壞中起重要作用[21]。另外，FLS受到IL-1和TNF-α等炎癥細胞因子的刺激會分泌IL-6[22]。同時，IL-6刺激對FLS也會產生重要影響，Narazaki等[23]認為IL-6在FLS或其他細胞中誘導血管內皮生長因子，且IL-6刺激FLS和成骨細胞產生核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，RANKL激活破骨細胞，導致骨質疏松和關節破壞。Kaneshiro等[24]通過檢測細胞周期調節子p16INK4a、p21Cip1、p27Kip1及細胞周期蛋白依賴性激酶4、細胞周期蛋白依賴性激酶6的表達，證實IL-6和TNF-α協同調節細胞周期并促進RA-FLS增殖。因此，IL-6與滑膜細胞的增殖和炎癥反應密切相關[25]。

1.4IL-17 IL-17包括從IL-17A到IL-17F的6個家族成員，其中IL-17A和IL-17F是主要的成員，兩者均通過與IL-17受體A和IL-17受體C結合起作用[26]。IL-17是對先天性和獲得性免疫應答至關重要的促炎細胞因子之一，主要由輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)17分泌，也可由中性粒細胞、肥大細胞、嗜酸粒細胞等細胞誘導產生[27]。研究顯示，IL-17能抑制滑膜細胞的凋亡[28]、促進滑膜細胞的增殖和介導炎癥的產生[29]。Lee等[30]研究發現，與骨關節炎患者相比，RA患者FLS中抗凋亡基因Bcl-2表達水平較高，而IL-17進一步上調了RA-FLS中Bcl-2的表達，同時CCK-8(Cell Counting Kit-8)檢測顯示IL-17促進FLS的增殖。另有學者從細胞凋亡調控基因-程序性細胞死亡因子5方面進行研究發現，RA患者滑液中的程序性細胞死亡因子5水平和IL-17水平呈負相關，表明IL-17與滑膜細胞增殖有關[31]。在介導炎癥方面，Hirota等[32]證實粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是自身免疫性關節炎的關鍵炎癥介質，Th17細胞通過IL-17刺激FLS分泌GM-CSF，導致RA炎癥的發展。同時，有研究證實IL-17在促進FLS中IL-6、IL-8和粒細胞集落刺激因子以及MMP的產生中具有增強和協同效應，且特異性抗IL-17抗體在體外阻斷細胞因子和趨化因子反應方面表現出良好的效果[33]。Shui等[34]研究發現，IL-17A通過誘導FLS中MMP-13的表達來抑制共培養系統中軟骨細胞Ⅱ型膠原纖維α1基因信使RNA和蛋白的表達，從而增加膠原蛋白的降解并在RA相關的軟骨損傷中發揮作用。van Nieuwenhuijze等[35]在小鼠關節內聯合注射GM-CSF腺病毒表達載體和IL-17腺病毒表達載體揭示了滑膜中MMP、NF-κB配體的受體激活劑RANKL和IL-23產生的累加和協同作用，導致關節破壞，而聯合注射IL-17和GM-CSF的抗體治療顯著降低關節破壞程度。可見，IL-17能促進FLS的增殖、誘導炎癥細胞因子、與其他細胞因子產生協同作用及增強MMP的表達，對滑膜炎癥、關節破壞有重要影響。因此，IL-17可以作為治療RA的重要靶點。

2 HIF與滑膜細胞

HIF是由一個α亞基和一個β亞基組成的異二聚體分子，被認為是調節細胞氧平衡反應基因表達的核轉錄因子，HIF-α分為HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三個α亞基，HIF能調節低氧環境的適應性反應，而缺氧是RA的重要微環境特征。研究證明，缺氧和HIF調節RA的許多重要病理生理特征，包括滑膜炎癥和軟骨破壞等[36]。HIF-1α在多種類型細胞中普遍表達，其對滑膜細胞增殖、炎癥等有影響。

HIF-1α在RA滑膜組織中高表達，能促進滑膜細胞的增殖[37]。Li等[38]研究表明，HIF-1α可上調CXC趨化因子受體4，而CXC趨化因子受體4與基質細胞衍生因子-1結合促進RA-FLS活化、遷移和增殖。對于HIF-1α信號的抑制則減弱了RA患者滑膜中激活的FLS的侵襲性[39]。在RA滑膜細胞中，HIF-1α能影響FLS與T細胞和B細胞之間的關系，能誘導炎癥細胞因子、細胞間接觸介質、趨化因子、血管細胞黏附分子的產生[40]。Lee等[41]發現，RA-FLS的存活可以通過B細胞活化因子表達控制、受HIF-1α與B細胞活化因子啟動子結合的調節。另有文獻報道，HIF-1α的過表達可增強RA-FLS介導的炎癥性Th1和Th17細胞的擴增，并增強Toll樣受體配體刺激的RA-FLS中炎癥細胞因子的表達，從而引起RA向炎癥性狀態的轉變；在RA微環境條件下，低氧和HIF-1α可能與Toll樣受體刺激的先天性免疫反應共同發揮作用，以驅動RA炎癥[42]。同時，HIF-1α又受細胞因子、相關刺激蛋白等調控而影響滑膜細胞。Hu等[43]研究表明，IL-33可以在RA-FLS中誘導更多的HIF-1α表達，從而形成HIF-1α/IL-33調節回路，進一步增加HIF-1α的表達。Park等[44]發現，高遷移率族蛋白B1通過Toll樣受體4/NF-κB信號通路誘導HIF-1α表達及其活性的增加，從而誘導血管生成。Li等[45]在研究民族藥刺老苞提取物對FLS的細胞凋亡作用時，發現該提取物降低了抗細胞凋亡因子Bcl-2、HIF-1α和磷酸化蛋白激酶B的蛋白水平，表明FLS的細胞凋亡誘導作用與細胞凋亡相關蛋白的表達調節和對蛋白激酶B/HIF-1α信號通路的抑制有關。另外，在低氧條件下IL-17A誘導MMP-2和MMP-9的表達時可發現，NF-κB/HIF-1α的激活增加，表明IL-17A還可通過激活NF-κB/HIF-1α途徑上調MMP-2和MMP-9的表達促進RA-FLS的遷移和侵襲[46]。

已有研究證明，缺氧條件下的RA-FLS經歷上皮-間充質轉化，細胞遷移和侵襲增加，而缺氧誘導的上皮-間充質轉化伴隨HIF-1α表達的增加和蛋白激酶B的激活，進一步影響FLS的遷移和侵襲[47]。在研究IL-17與缺氧在FLS中的作用時，Samarpita等[48]認為IL-17和缺氧協同增強滑膜巨噬細胞中HIF-1α、MMP-9的表達，而HIF抑制劑可消除IL-17和缺氧介導的HIF-1α和MMP-9表達。另有實驗證明，關節缺氧可能會不同程度地影響RA-FLS中IL-1β 刺激的MMP-1和MMP-13表達，而HIF-1α基因敲除可明顯緩解缺氧對MMP-1和MMP-13表達的影響，表明由低氧介導的IL-1β刺激的RA-FLS中MMP-1和MMP-13表達的差異取決于HIF-1α的表達[49]。因此，測試針對靶向HIF-1α的療效時，應考慮這種低氧介導的差異作用。

3 miRNA與滑膜細胞

miRNA是一類內源性非編碼小RNA，其具有組織或發育階段特異性的表達模，通過結合靶信使RNA 3′非翻譯區中的互補區來調節轉錄后水平的基因表達[50]。研究發現，miRNA不僅在調節免疫功能中具有重要作用，還可通過調控細胞信號中某些信號分子(細胞因子、轉錄因子、生長因子等)的表達來調節細胞代謝和發育、促進細胞增殖與分化、調控細胞凋亡[51-52]，在RA中起重要作用。其中，常見與滑膜細胞有關的miRNA包括miR-124、miR-155、miR-142等。

3.1miR-124 miR-124具有重要的細胞抑制作用，以往其在腫瘤抑制方面有大量研究，近年來研究將其作為自身免疫性疾病的新型診斷指標[53]。研究發現，miR-124a在RA-FLS中的表達水平明顯降低，占骨性關節炎成纖維細胞表達水平的1/6[54]，將miR-124a的前體轉染至RA-FLS后可抑制其細胞增殖、使細胞周期阻滯在G1期。有學者分析了RA和骨性關節炎患者滑膜組織中miR-124a基因的甲基化狀態，證明該基因啟動子僅在RA中被甲基化，可能與miR-124a下調有關[55]。鑒于RA-FLS中miR-124的低表達情況，學者對miR-124的調控進行了研究，發現其能抑制大鼠佐劑誘導的關節炎，表現為滑膜細胞增殖減少，白細胞浸潤和軟骨或骨破壞減少[56]。Yang等[57]研究也表明，miR-124a不僅能抑制RA-FLS的活性和增殖，增加G1期細胞的百分比，還能抑制促炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達。因此，miR-124在FLS的炎癥和增殖抑制方面起重要作用，其將成為RA治療的重要靶點，如以負載miR-124的方式用于RA治療[58]。

3.2miR-155 miR-155是一種多功能miRNA，對于免疫應答必不可少，其能調節樹突狀細胞的成熟，控制B細胞增殖，是T細胞分化的調節劑，也是RA免疫慢性激活的關鍵介質[59]。研究發現，與骨性關節炎成纖維滑膜細胞相比，RA-FLS中miR-155表達上調，miR-155的過表達在體外也能抑制RA-FLS的侵襲，且用miR-155模擬物轉染的RA-FLS能降低MMP-3水平，但沉默miR-155能明顯升高MMP-3水平[60]。Li等[61]研究表明，miR-155通過調節Wnt信號通路抑制RA-FLS的活力并誘導細胞凋亡。同時有研究認為，miR-155在促炎激活中起關鍵作用，其能減少細胞因子信號轉導抑制蛋白1的表達，可能有助于RA患者的TNF-α和IL-1β產生增加[62]。Liu等[63]研究發現，TNF-α能誘導FLS增殖，而miR-155抑制劑可減少TNF-α誘導的FLS增殖及IL-6和IL-1β產生。因此，miR-155不僅能降低MMP-3水平，還能增加促炎癥細胞因子的產生，但miR-155的多功能性是否參與了不同的調節機制需進一步探討。

3.3miR-142 miR-142編碼兩種成熟的miRNA：miR-142-5p和miR-142-3p[64]，其是器官形成、體內穩態的多方面調節劑，在疾病中也起重要作用，如在癌癥、病毒感染、炎癥和免疫耐受中發揮功能性作用[65]。與骨性關節炎滑膜成纖維細胞相比，miR-142-3p、miR-142-5p在RA-FLS中的表達水平明顯上調[66]。Meng等[67]研究發現，脂多糖刺激RA-FLS下調了miR-142-3p，而丹酚酸B通過上調miR-142-3p、調節NF-κB和c-Jun氨基端激酶途徑預防和逆轉細胞損傷，具有抗凋亡和抗炎作用。同時，有學者發現下調miR-142-3p能抑制TNF-α誘導的RA-FLS增殖、侵襲和炎癥；且miR-142-3p下調通過靶向IL-1受體相關激酶抑制NF-κB信號轉導[68]。可見，miR-142-3p在腫瘤研究中具有雙重作用，其可能在RA滑膜細胞中發揮不同的調控作用，今后需進一步探索。

4 小 結

RA是一種慢性炎癥性免疫疾病，隨著研究的深入發現，RA的特征為發炎的滑膜中滑膜細胞的增殖，以及炎癥因子的滑膜細胞表達，因此其治療策略通常集中于控制這些細胞的增殖和炎癥介質[69]。目前，RA的病因病機尚未明確，其進展也被認為是多因素綜合作用的結果，因此在研究影響滑膜細胞的因素中，需進一步探索細胞因子之間的等級關系、HIF及miRNA的調節體系。同時，也有學者研究了HIF、miRNA、細胞因子三者在軟骨細胞中的表達[70]。今后在研究RA滑膜細胞時應多考慮三者之間的關系，以尋找更好的RA治療手段。