基因芯片在牙周微生物檢測中的研究進展

張藝齡，徐杰

(昆明醫科大學附屬口腔醫院牙周病科，昆明650000)

牙周炎是一種多因素共同影響的，累及4種牙周支持組織(牙齦、牙周膜、牙骨質及牙槽骨)的炎癥性和破壞性疾病[1]，牙周微生物是牙周炎的始動因素。部分牙周微生物具有顯著的毒性或致病性，通過多種機制干擾宿主防御能力，直接或間接引發牙周組織破壞，在牙周炎的發生和發展中發揮重要作用[2]。因此，了解并檢測牙周微生物有利于進一步明確牙周致病微生物，針對性選擇特異性藥物，評估患者預后。檢測致病微生物的方法有很多，如分離培養法、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，其中PCR應用最廣泛。隨著基因組計劃的快速發展，基因芯片技術也開始用于疾病研究，具有簡便快速、靈敏度高、特異度高及自動化等特點[3]。越來越多的學者開發并利用基因芯片檢測牙周微生物，分析不同牙周疾病中口腔微生物群的特點和變化，以期進一步了解牙周疾病與牙周微生物的關系[4-5]。基因芯片技術有助于牙周病的病因、診斷、治療以及預后評估的研究。現對現有基因芯片技術及其應用于牙周致病微生物檢測的情況進行綜述。

1 牙周微生物及常規檢測方法

口腔中有700多種微生物，以細菌為主，其中絕大部分細菌為口腔正常細菌，僅部分細菌與牙周病的發生、發展相關，具有顯著的毒力或致病性，通過多種機制干擾宿主的防御能力，具有引發牙周破壞的潛能，稱為牙周致病菌[6]。目前已知的牙周致病菌有11種，包括伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、具核梭桿菌等。除已知的牙周致病菌外，口腔中還存在一些與牙周炎發生發展密切相關的細菌，如厭氧消化鏈球菌、侵蝕艾肯菌，其在牙周炎的齦下菌斑中的檢出率較高[7]。在牙周病的病因學研究中，除細菌外，病毒(如皰疹病毒)也在牙周病的發生中發揮作用[8]。人巨細胞病毒、EB病毒和單純皰疹病毒1型可能是與牙周病進展有關的皰疹病毒[9-10]。這些病毒通過降低宿主抵抗力，為牙周細菌的定植和繁殖創造條件，進而快速破壞牙周組織[8]。有研究表明，牙周細菌和皰疹病毒共同感染會增加侵襲性牙周炎的患病風險[11]。由于口腔微生物群是一個高度復雜的生態系統，因而有學者認為牙周菌群與宿主的生態失衡是牙周炎形成的原因，并非由某些牙周細菌決定[12]，所以了解并檢測牙周微生物有重要意義。另外，侵襲性牙周炎和部分慢性牙周炎患者進行基礎治療后仍需輔助性使用抗生素[13]，而不恰當的抗生素治療可能會造成致病菌的耐藥[14]，所以針對性用藥顯得更為重要，而最佳抗生素方案的選擇應基于微生物分析。

常規檢測致病微生物的方法主要是分離培養法和PCR。分離培養法是檢測微生物的金標準，但該方法只針對活菌，且培養周期長，耗時費力，特別是對于牙周致病菌中的厭氧菌，培養條件高且不易成活，因而應用具有一定的局限性[15-16]。相較細菌分離培養法，常規PCR及其衍生技術解決了厭氧菌不易培養的問題，縮短了檢測周期和步驟，提高了檢測的靈敏度和特異度[7,17]。但常規PCR一次只能檢測一種已知的優勢菌群，不能同時檢測多個菌種，對于多種細菌共同感染的復雜樣本不能很好地分析細菌的多樣性，且只有實時熒光定量PCR能進行致病微生物的定量分析[18-19]。隨著科學技術的發展，具有局限性的常規檢測方法已不能滿足研究者的檢測要求。

2 基因芯片技術

2.1基因芯片概念 基因芯片又稱DNA微陣列、DNA芯片，是將大量特定的已知的DNA序列有序地固定在固相載體表面，然后與標記的待測樣品進行雜交，通過熒光檢測系統對雜交信號進行掃描分析，繼而獲得大量與基因相關的信息[20]。探針序列最常選自GeneBank和RDP等數據庫[18]，而要分析的樣品可以是PCR產物、互補DNA、基因組DNA、質粒DNA或寡核苷酸等[16]。檢測時樣本先行PCR擴增后摻入熒光或放射性同位素進行標記，再將設計合成的基因芯片與樣品中的RNA或DNA序列雜交[3]，通過檢測從樣品雜交中獲得的熒光信號強度分析核酸量，進而估計樣本微生物的數量或基因表達水平[5]。

2.2基因芯片的優缺點 基因芯片的主要優勢是高通量、多樣性、并行性、自動化和準確性[3]，其能在幾小時內同時檢測出多種微生物，與細菌培養法和PCR相比，很大程度上縮短了檢測的時間和工作量，是一種快速、簡便、特異、高通量的檢測技術[21]。該技術還能檢測多種細菌，同時分析細菌菌群的多樣性和豐富度[22]。劉杰等[18]成功制備了包含11種腹瀉相關致病菌基因的檢測芯片，該基因芯片檢測的靈敏度較PCR技術高10倍。基因芯片也有不足之處，其是針對已知微生物設計的寡核苷酸探針，并不能檢測未知微生物[23]，且目前基因芯片采用定性半定量的快速檢測方法[22]，對于需要定量檢測的微生物仍需借助實時熒光定量PCR技術才能實現。

3 基因芯片在牙周微生物中的應用進展

基因芯片技術可用于分析微生物的基因組，進行微生物基因分型與微生物種類鑒定[24]，也可分析基因表達及微生物感染期間宿主基因表達變化[25]，篩選監測微生物抗藥性的基因[26]，用于癌癥等疾病的診斷[27]。有研究者利用基因芯片檢測牙周微生物，分析不同牙周疾病中口腔微生物群的特點及變化，其中人類口腔微生物鑒定芯片(human oral microbe identification microarray，HOMIM)在口腔微生物群檢測中應用廣泛。

3.1HOMIM的應用

3.1.1HOMIM HOMIM由美國波士頓Forsyth研究所基于細菌16S rRNA基因片段研發，包含400多對探針，用于檢測300多種口腔細菌的基因芯片[28]。HOMIM將基于16S rRNA反向捕獲的DNA探針固定在載玻片上，使用16S rRNA通用引物擴增樣本DNA，并在擴增中摻入熒光素進行標記，將標記的擴增片段與HOMIM上的探針雜交，使用Axon 4000B掃描儀掃描微陣列玻片并提取數據[22]。HOMIM的讀數為每個檢測序列的相對信號強度，范圍為0～5，信號越強檢出率越大[29]。與常見的牙周致病菌檢測技術相比，HOMIM 擴大了樣本檢測的細菌種類，很大程度上減少了工作量和工作時間[30]，其可以像高通量測序一樣同時獲得DNA樣品中菌群組成的多樣性和豐富度[31]。有研究者比較了HOMIM和高通量測序對牙周菌群組成的檢測情況發現，兩種檢測方法在物種檢測上基本一致，但高通量測序在同一樣品中檢測到的物種數量是HOMIM的2倍[32]。也有研究者發現，HOMIM雖然在物種檢測廣度上沒有高通量測序大，但在齦下菌群的特定菌種檢測方面靈敏度更高[33]。

3.1.2研究菌斑生物膜相關菌群 菌斑生物膜是牙周炎形成的始動因子，隨著疾病進展，菌斑生物膜相關菌群也發生變化[12]，通過HOMIM可研究菌斑生物膜的形成，為牙周炎的病因學研究提供依據[34-35]。有學者采用HOMIM研究早期菌斑生物膜形成過程中細菌群落多樣性與時間的關系，動態分析早期菌斑生物膜細菌群落的組成[22]。HOMIM也可用于研究干預措施(口腔衛生宣教)對菌斑生物膜相關菌群的影響，為疾病的預防提供理論依據[36]。以上研究提示，HOMIM可動態分析菌斑生物膜的形成和不同干預措施對菌斑生物膜的影響，有助于牙周炎的病因學研究。

3.1.3研究不同牙周病的相關菌群 牙周病分為牙齦炎、慢性牙周炎(輕度、中度和重度)、侵襲性牙周炎(廣泛型和局限性)和種植體周圍炎等。口腔微生物群是一個復雜的生態系統，明確不同牙周疾病相關菌群的組成和差異，能夠進一步了解牙周病的發病機制，有助于牙周病的病因學研究和診斷[12]。HOMIM可用于研究難治性牙周炎、重度牙周炎、可治性牙周炎和牙周健康者齦下菌群的組成和差異[5,28]，為評估牙周病的預后及制定后續治療方案提供信息。HOMIM還被用于比較廣泛型侵襲性牙周炎和牙周健康者齦下菌群的組成和差異，研究齦下菌群與性別、年齡和臨床參數的關系[30]。種植體在口腔內受菌群影響也會發生種植體周圍炎，治療種植體周圍炎過程中，HOMIM可用于分析釉質基質衍生物對種植體周圍炎再生治療的效果[37]。以上研究提示，HOMIM可用于分析不同牙周病和不同干預措施下的菌群組成和差異，有助于牙周病的病因研究、診斷和治療。

3.1.4研究系統疾病與牙周菌群的關系 牙周微生物不僅與牙周病的形成有關，還可作為病灶與全身系統性疾病相關，分析系統疾病患者的牙周菌群，能更好地了解兩者之間的關系。Albandar等[31]使用HOMIM研究掌跖角化-牙周破壞綜合征患者的齦下菌群組成發現，患者的齦下菌群組成和慢性牙周炎和侵襲性牙周炎的齦下菌群相似。Bassir等[38]使用HOMIM檢測了Hutchinson-Gilford早衰綜合征患兒牙齦退縮部位的齦下菌群組成，未發現典型的牙周致病菌，而是口腔卟啉單胞菌和齒齦普氏菌，提示其他細菌可能與該病的牙齦退縮有關。糖尿病的發生發展與牙周炎相互影響，采用HOMIM檢測發現，齦下菌群變化與糖尿病患者全身炎癥和胰島素抵抗有關[29]。以上研究評估了系統疾病與牙周組織破壞相關菌群間的關系，提示齦下微生物群可作為部分系統疾病狀態的潛在標志。

3.2商品化基因芯片的應用 用于檢測口腔微生物的商品化基因芯片是根據選定細菌設計合成并投入生產的成品，包括ParoCheck?試劑盒、StomaGene?試劑盒等。商品化的基因芯片所包含的細菌探針從幾種到十幾種，主要用于選定細菌的鑒定，特別是多種微生物感染的快速檢測。商品化的基因芯片是一種可靠的微生物檢測方法，可用于檢測不同牙周狀態下細菌的組成和差異，分析牙周炎與牙周細菌的關系，具有較高的靈敏度和特異性。商品化基因芯片可通過檢測牙周致病菌輔助診斷和治療牙周炎[39]。有研究者用商購的StomaGene?試劑盒和ParoCheck?試劑盒分析患齲兒童牙齦炎癥部位和健康部位的牙菌斑發現，StomaGene?試劑盒和ParoCheck?試劑盒對不同細菌檢測的靈敏度不一樣[40]，提示應考慮用多種試劑盒檢測同一樣本以提高牙周細菌的檢出率。商品化的基因芯片具有快速、簡便、靈敏、特異等優勢，可用于監測不同牙周炎菌群中常見牙周細菌的組成和變化，為牙周炎的診斷和治療提供幫助。此外，由于商品化的基因芯片質量不一，應考慮用多種試劑盒提高牙周微生物的檢出率。

3.3基因芯片的應用前景 除HOMIM和商品化的基因芯片外，也可以根據需要開發新的基因芯片，用于檢測不同牙周疾病樣本或同一疾病不同部位的樣本[41]。基因芯片除了可以檢測細菌外，也可檢測真菌、病毒等，或根據需要在基因芯片上自由設計寡核苷酸探針用于檢測所需的微生物[27,42]。Yang等[43]研發并驗證了一種包括16種細菌、5種病毒、4種寄生蟲和2種真菌探針的DNA微陣列用于檢測腹瀉患者糞便，為胃腸道感染的病因學研究和診斷提供依據。Debaugnies等[44]用DNA微陣列檢測了造血干細胞移植患者血液樣本中的皰疹病毒發現，DNA微陣列較常規PCR能更快速檢測出人巨細胞病毒和EB病毒。目前應用于牙周微生物檢測的基因芯片主要檢測細菌，未考慮病毒特別是皰疹病毒在牙周炎中的作用[8,10]，而病毒相關的基因芯片也有其應用前景和理論依據，這對以后設計并應用細菌和病毒等結合的基因芯片有一定指導意義。

4 小 結

檢測微生物的方法多種多樣，而基因芯片技術因具有高通量、多樣性、并行性、自動化、準確性、特異性和靈敏度高及簡便快速等優點，已經成為一種不可替代的快速、準確和批量檢測牙周微生物的方法。基因芯片既可檢測細菌、真菌、病毒，也可根據需要在基因芯片上自由設計寡核苷酸探針用于檢測所需的微生物。基因芯片技術有利于快速明確致病微生物，分析樣本中微生物的多樣性和豐度，有助于研究牙周病的病因、診斷、治療和評估預后。但基因芯片只能檢測已知微生物，并不能檢測出未知微生物，且目前基因芯片采用的是定性半定量的快速檢測方法，對于需要定量檢測的微生物仍需借助實時熒光定量PCR技術實現。如何在基于基因芯片的優勢上，實現對未知微生物的檢測將是未來研究的熱點。