細胞鐵死亡發生機制的研究進展

梅勝蘭，夏中元，孟慶濤，周金劍

(武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060)

鐵死亡是Dolma等[1]用小分子化合物Erastin誘導Ras癌基因突變的人包皮成纖維細胞死亡時發現的一種程序性細胞死亡方式，使用凋亡、壞死、自噬、焦亡等抑制劑均不能逆轉Erastin和谷胱甘肽過氧化物酶抑制劑RSL3導致的細胞死亡，而抗氧化劑(維生素E)和鐵螯合劑(去鐵胺)卻能逆轉。2012年，Dixon等[2]將Erastin誘導的具有自己獨特形態學、基因學、生物化學特征的細胞死亡方式正式命名為鐵死亡。在形態學方面，鐵死亡主要表現為線粒體膜固縮，膜密度增加，線粒體嵴模糊不清、減少或消失，細胞核膜完整[3]；在生化方面，表現為鐵離子水平升高，產生大量活性氧類(reactive oxygen species，ROS)，谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)活性下降，脂質代謝產物堆積；在分子機制上，有研究發現，核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)在葉酸誘導的急性腎損傷小鼠中通過抑制鐵死亡發揮腎臟保護作用，這可能是Nrf2除抗氧化應激、抗炎等保護作用外的另一個嶄新機制[4]，而GPx4是Nrf2轉錄途徑介導的唯一基因，是有效修復氧化損傷的硒蛋白，因此Nrf2/GPx4是調控細胞鐵死亡的關鍵信號通路。

細胞鐵死亡存在于多種疾病的病理生理過程中，研究發現在腫瘤疾病中，其可通過誘導細胞鐵死亡殺滅腫瘤細胞；在神經退行性疾病中，可通過抑制細胞鐵死亡延緩疾病的進展[5]。然而，鐵死亡的研究仍處于早期階段，還有很多問題尚待解決。現就細胞鐵死亡的發生機制予以綜述，以為鐵死亡的深入研究及臨床疾病的防治提供新靶點與理論基礎。

1 鐵死亡發生的相關機制

1.1鐵離子調控

1.1.1鐵代謝 鐵是機體不可缺少且含量最豐富的微量元素，其參與體內多種重要的生理生化功能。鐵是血紅蛋白和肌紅蛋白合成主要原料，其不僅參與了DNA、ATP的生物合成，也是線粒體中重要的電子傳遞鏈和金屬蛋白酶的輔助因子，如鐵硫蛋白不僅是線粒體電子傳遞鏈中氧化還原酶類的重要輔助因子，還是氧化還原反應過程中許多重要酶的輔助因子[6]，包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、泛醌等。因此，機體健康的維持，鐵至關重要。正常條件下，機體通過食物來源的鐵和“鐵循環”(衰老的紅細胞在血紅素加氧酶作用下釋放鐵離子，巨噬細胞再次吞噬回收利用鐵的過程)保持鐵的動態平衡。由肝臟合成分泌的鐵調素直接調控血清鐵的水平，而機體細胞內鐵穩態的調節，則主要通過鐵調控蛋白系統——鐵反應元件發揮作用。外周循環中的三價鐵離子(Fe3+)與轉鐵蛋白結合形成復合物后與細胞膜上的轉鐵蛋白受體結合，進入細胞內的內涵體，此時的Fe3+通過鐵氧還原酶Steap3(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate)還原為二價鐵離子(Fe2+)，隨后在二價金屬離子轉運蛋白1的介導下，Fe2+從內涵體解體釋放到細胞質，一部分儲存于不穩定的鐵池，過多的鐵則存儲在鐵蛋白輕鏈多肽和鐵蛋白重鏈多肽1組成的鐵儲存蛋白復合物中，剩余部分Fe2+將被氧化成Fe3+轉出細胞，參與體內鐵再循環。

1.1.2鐵離子與脂質過氧化 當體內鐵的分布、含量異常時，就會發生各種損傷與疾病。有研究將Fe2+加入脊髓神經元的培養液中，發現鐵離子的水平與脂質自由基、丙二醛等過氧化產物的產生量呈正相關，而神經元的活性與脂質過氧化產物產生量呈負相關，說明鐵與ROS是鐵死亡的啟動子與介質[7]。研究表明，含有多不飽和脂肪酸的細胞膜、質膜等特別容易與脂質自由基發生過氧化反應，而在Fe2+的存在下，這種反應速度極大提高[8]。另有研究發現，抗氧化劑(α維生素E和β胡蘿卜素等)和鐵螯合劑(去鐵胺)能夠顯著抑制Erastin誘導的細胞鐵死亡，說明鐵穩態和脂質過氧化是細胞鐵死亡發生的關鍵環節[2]。鐵也是鐵死亡的必要條件，補充鐵離子可以加速Erastin 誘導的細胞鐵死亡，而其他二價金屬離子卻沒有此作用。

上述結果揭示一種現象：鐵離子水平越高，脂質過氧化反應越強烈，細胞損傷即鐵死亡越嚴重。鐵離子啟動脂質過氧化的反應為：當組織損傷或缺血缺氧時，細胞代謝發生障礙，pH下降致細胞內Fe3+還原成Fe2+，Fe2+通過與過氧化氫發生Fenton反應促進了氧自由基的產生，其中羥自由基最具有破壞性，其不僅能夠在體內與其鄰近的分子發生急速反應，同時還能夠促進與細胞的脂質成分發生過氧化生成大量脂質自由基，由于細胞膜、質膜含有豐富的多不飽和脂肪酸，脂質自由基如同級聯反應，進一步導致細胞膜、質膜變薄失去屏障作用，細胞內ROS隨即加劇破壞胞膜、質膜，并在細胞膜上形成蛋白質孔，導致細胞內穩態紊亂[9]，激活更嚴重的生化反應；另一方面，脂質自由基損傷細胞的脂質結構，產生的脂質過氧化產物(4-羥基壬烯醛、丙二醛等)并沒有靜止，而是繼續反應，不斷破壞細胞，最終導致細胞膜、質膜的結構和功能不可逆的破壞，這就是鐵依賴性的脂質過氧化死亡即鐵死亡。見公式(1)、(2)[10]。

Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH

(1)

(2)

鐵螯合劑能夠直接作用于含鐵離子的酶，其中以脂氧合酶的可能性最大，因為它能催化多不飽和脂肪酸氧化，并能直接被親脂性鐵螯合劑失活。而Dixon和Stockwell[11]認為，鐵具有在有氧條件下極易與其他物質交換電子的特性，鐵螯合劑之所以抑制細胞鐵死亡，其原因可能為：鐵是很多重要金屬酶的輔酶，其阻止了鐵向氧化物傳遞電子，從而抑制氧自由基的產生，即抑制了細胞脂質過氧化，進而抑制了鐵死亡的發生。

1.2Nrf2/GPx4途徑 Nrf2基因位于人染色體 2q31.2，其編碼的蛋白是一種具有亮氨酸拉鏈結構、含有605個氨基酸的轉錄因子，不僅能夠調控細胞內穩態的平衡，還能對抗機體外源性和內源性氧化損傷，調節人類抗氧化蛋白的表達，是氧化還原的關鍵基因。Nrf2對細胞內的Fe2+具有調控作用，正常條件下Nrf2保持無活性狀態，當受到ROS刺激或親電子物質等誘導時就發生分子構象改變，激活下游的抗氧化酶發揮抗氧化、抑制細胞鐵死亡的作用[12]；另有研究發現，鐵死亡的相關基因包括Nrf2，上調Nrf2，其下游的抗氧化蛋白基因(如GPx4和血紅素加氧酶1)表現為促進編碼轉錄；而敲除Nrf2基因或Nrf2靶基因的肝細胞肝癌細胞可增強鐵死亡誘導劑Erastin或索拉菲尼誘導的鐵死亡[13]。Nrf2抑制劑(如全反式視黃酸、葫蘆巴堿、鴉膽子苦醇)通過抑制金屬硫蛋白1G(一種富含半胱氨酸殘基的蛋白質)的表達，增加了谷胱甘肽的消耗、脂質過氧化，促進索拉非尼誘導的鐵死亡[14]，進一步證實 Nrf2 具有抑制鐵死亡的作用。而GPx4是Nrf2轉錄介導的基因，是能夠特異地將高毒性的脂質過氧化氫轉化成無毒的脂醇，將過氧化氫分解成水，是一種對哺乳動物中不飽和脂肪酸的氧化損傷能夠有效修復的硒蛋白[15]。有文獻報道，敲除小鼠GPx4基因或使用GPx4抑制劑RSL3能導致細胞內超氧陰離子和羥自由基明顯增加以及脂質過氧化，最后誘導細胞鐵死亡的發生[16]；而GPx4基因全身敲除，則小鼠胚胎在7.5 d死亡[17]。因此，抗氧化酶GPx4是鐵死亡發生的至關重要的調控蛋白，而Nrf2/GPx4是調控細胞鐵死亡的關鍵信號通路。

1.3胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(cystine/glutamate antiporter，System XC-) System XC-是一個膜Na+依賴的氨基酸反向轉運體，廣泛分布于生物細胞的磷脂雙分子層，是由輕鏈溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)和重鏈溶質載體家族3成員2組成的異二聚體，當攝取一分子胱氨酸的同時外排一分子谷氨酸[18]。在細胞內，胱氨酸首先被還原為半胱氨酸，然后在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶的作用下合成谷胱甘肽，谷胱甘肽在抗氧化應激、減輕脂質過氧化反應、保護組織細胞等方面發揮至關重要的作用。當System XC-被阻斷時，谷氨酸與胱氨酸不能互換，導致細胞內谷氨酸堆積，谷胱甘肽合成減少，GPX4活性降低，從而使細胞發生鐵死亡[19]；研究報道，基因沉默SLC7A11表達會使HT-1080細胞對鐵死亡誘導劑Erastin誘導的鐵死亡更加敏感，而將HT-1080細胞過表達SLC7A11后，細胞對鐵死亡的耐受明顯增強[20]。可見，System XC-對細胞鐵死亡有重要作用。

1.4電壓依賴性陰離子通道 (voltage-dependent anion channel，VDAC) VDAC位于線粒體外膜，具有調節線粒體的代謝和產能功能，并參與細胞生存和死亡信號的調節，是轉運離子和代謝產物的跨膜通道，包括VDAC1、VDAC2和VDAC3等多種亞型。VDAC開放時允許呼吸底物、ADP、磷酸進入線粒體，在關閉狀態下則封閉線粒體的轉運功能[21]。動態“開放-封閉”將對線粒體代謝和細胞生物能量產生重大影響。微管蛋白是VDAC上的一種球形蛋白，它可以通過阻塞VDAC來動態調節線粒體代謝及離子的轉運[22]。VDAC被微管蛋白阻塞而關閉后，限制代謝物流入線粒體和ATP產生，隨后線粒體代謝被抑制并維持較低ATP/ADP比值，從而減少氧化應激。Erastin可抑制 VDAC上的微管蛋白功能，阻止細胞質游離微管蛋白對VDAC的阻塞，使VDAC開放。VDAC開放會引起線粒體代謝增加，糖酵解減少，ROS生成增加。研究發現，鐵死亡誘導劑Erastin作用于VDAC后，線粒體外膜的通透性增加，膜離子通道開放，細胞內穩態失衡，導致線粒體代謝及氧化功能紊亂，ROS生成增加，脂質過氧化增強，進而引起細胞鐵壞死的發生[23]。另有研究表明，抑制VDAC2或VDAC3表達后，細胞對Erastin誘導的鐵死亡不敏感，但上調VDAC2或VDAC3，Erastin誘導鐵死亡的敏感性并沒有明顯提高，提示VDAC2或VDAC3并非鐵死亡的必需條件[24]，而只是參與了鐵死亡調節的過程。有文獻報道，VDAC1蛋白主要維持線粒體中鈣離子平衡和ROS水平，因此也與鐵死亡發生密切相關[25]。

1.5p53 p53是抑癌基因，其對調控細胞的生長周期、影響腫瘤細胞代謝、誘導細胞凋亡、促進DNA損傷等有重要影響。研究發現，p53除了抑制腫瘤外，對機體的衰老、帕金森病、阿爾茨海默病等神經退行性疾病發揮限制作用[26]。Jiang等[27]研究發現，p53通過乙酰化致突變后，能夠抑制System XC-活性，下調SLC7A11的表達，抑制胱氨酸進入細胞，減少谷胱甘肽合成，降低GPx4活性，從而促進脂質過氧化，誘導細胞鐵死亡的發生；同時，他們還發現激活p53基因后，存在于線粒體外膜的SLC7A11基因信使RNA在腫瘤細胞中呈高表達，可抑制p53基因的負調控，從而證實SLC7A11為p53基因的新靶點。近年研究發現，p53能通過增強谷氨酰胺酶2的活性，催化谷氨酸大量產生，因胱氨酸與谷氨酸以1∶1轉運，故細胞內高濃度谷氨酸必然減少胱氨酸進入細胞，從而減少谷胱甘肽合成，誘發細胞鐵死亡的發生[28]。此外，有研究報道亞精胺/精胺N1-乙酰轉移酶1高表達可增強脂肪氧合酶活性，而p53通過增強此酶的活化功能，促進細胞不飽和脂肪酸氧化，導致細胞鐵死亡[29]。p53與鐵死亡的激活關系密切，在骨肉瘤、肺癌中表現更明顯，其機制與p53直接抑制System XC-有關，且在腫瘤的抑制與調節鐵死亡作用中，p53的乙酰化至關重要[30]。

2 鐵死亡與相關疾病

2.1鐵死亡與腫瘤 目前發現，多種腫瘤細胞對藥物誘導的鐵死亡十分敏感。如胰腺癌細胞對凋亡產生耐受，但對細胞鐵死亡敏感，Eling等[31]發現青蒿脂可誘導胰腺癌細胞鐵死亡，從而抑制腫瘤的生長；Lin等[32]發現，雙氫青蒿素可誘導頭頸部鱗狀細胞癌細胞發生鐵死亡；西拉美新和拉帕替尼則可以誘導乳腺癌細胞發生鐵死亡[33]。因此，誘導腫瘤細胞發生鐵死亡從而抑制腫瘤的增殖與轉移，可能成為未來腫瘤治療的新靶點。

2.2鐵死亡與神經退行性疾病 阿爾茨海默病和帕金森病是臨床常見的神經退行性疾病，其發病率逐年增加，不僅嚴重影響患者的生活質量，也給家庭、社會造成沉重負擔，但其發病機制尚不明確。Ayton等[34]發現，在阿爾茨海默病患者大腦中鐵蛋白增多與阿爾茨海默病風險基因載脂蛋白E-ε4表達水平升高一致，表明大腦中鐵含量的增加影響阿爾茨海默病進程。在成年小鼠GPx4缺失模型中發現海馬神經元與星形膠質細胞減少，這與阿爾茨海默病患者的病理改變一致[35]；Pichler等[36]發現，帕金森病患者黑質致密部鐵含量增加，多巴胺能神經元氧化損傷明顯加重，谷胱甘肽耗竭，羥自由基水平升高，表明在帕金森病中，鐵死亡參與了多巴胺能神經元的變性死亡；Do等[37]發現，鐵死亡抑制劑ferrostatin-1能抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶對多巴胺能神經元的毒性作用，以上進一步表明鐵死亡參與了神經退行性疾病的病理過程。

2.3鐵死亡與臟器缺血再灌注損傷 在臟器缺血再灌注損傷中，存在細胞壞死、凋亡、自噬等。近來研究發現，在小鼠模型中，通過抑制細胞鐵死亡，可顯著減輕心臟、肝、腎、腦等的缺血再灌注損傷[38-39]；Tang等[40]發現，大鼠心肌缺血再灌注損傷后，鐵穩態調節通路被激活，鐵離子堆積，ROS生成增加，最終導致鐵離子依賴的氧化損傷即鐵死亡，表明鐵死亡參與了心肌的缺血再灌注損傷。因此，抑制細胞鐵死亡可能成為臨床防治臟器缺血再灌注損傷的新方法。

3 小 結

細胞死亡是機體正常新陳代謝的需要，是所有細胞的最終命運，在整個機體的正常運轉以及病理生理過程中具有不可替代的作用。線粒體基質和線粒體嵴是真核生物氧化代謝的場所，線粒體含有豐富的脂質，也是對缺血缺氧及各種損傷最為敏感的細胞器之一。而鐵死亡是鐵依賴的脂質過氧化物超量蓄積和ROS引起的細胞程序性死亡方式，線粒體嵴減少或消失，線粒體膜固縮是否可以作為鐵死亡早期的和特征性的形態學改變，有待進一步探討；另外，參與細胞鐵死亡的信號通路與其他調節性細胞死亡方式之間是否存在潛在的相關性也有待深入研究。相信隨著基礎與臨床研究的不斷進步，鐵死亡一定會更好地應用到臨床疾病特別是腫瘤的防治中。