外泌體miRNA與結直腸癌診斷的進展和意義

劉航，李顯，張林，王光輝，丁杰

(1.貴州省人民醫院 a.胃腸外科，b.乳腺外科，貴陽 550002； 2.遵義醫科大學，貴州 遵義563003)

結直腸癌已成為世界范圍內常見的惡性腫瘤。有數據顯示，結直腸癌的發病率在男性惡性腫瘤中居第三位，在女性中居第二位，且近年來發病率逐漸呈年輕化趨勢[1]。在臨床就診的患者中，晚期結直腸癌患者數量眾多且常伴轉移，預后不佳，5年生存率不足10%[2]。因此，癌癥的早期診斷對提高患者生存率具有重要意義。近年來，多種新型診療手段(如液體活檢、基因測序、免疫治療)不斷出現，可能有效改善患者預后的診療方式。液體活檢技術是近年來腫瘤診斷領域的一大突破性技術，通過捕獲和分析外泌體、核酸、蛋白質及細胞等腫瘤衍生物質來解讀癌細胞生物學進程。液體活檢技術包括了3種體外診斷技術，即血液的循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA和外泌體的檢測，其中探究外泌體包含物中的微RNA(microRNA，miRNA)作為腫瘤診斷標志物是一項關鍵性研究。而針對外泌體的研究發現，外泌體由供體細胞分離后可參與細胞的多種生理或病理過程[3]。腫瘤來源的外泌體包含的miRNA，較循環腫瘤細胞數量更多、更易富集，且穩定性更高，包含信息量更大，甚至具有用于治療的潛能，是目前研究的熱點[4]?，F就外泌體miRNA與結直腸癌診斷的最新研究進展予以綜述。

1 外泌體概述

外泌體最初被認為是網織紅細胞在分化過程中多囊核內體或多囊小體與細胞膜融合后形成的囊性小泡，屬于細胞外囊泡的一種，其大小目前尚無統一標準[5]。外泌體廣泛存在于外周血、唾液甚至尿液中，但豐度卻不同[6-7]。細胞囊泡運輸機制被發現后，外泌體成為細胞間信號分子的重要載體之一，在腫瘤精準治療中蘊藏著巨大潛能，而基于下一代基因組測序的分子分析方法應用于外泌體囊泡內容物的檢測，可更加全面、多參數綜合分析其內容物中核酸分子變異等信息，提升對腫瘤形成、發展過程的認知，這是實現對腫瘤早期診斷、精準用藥及預后分析的先決條件[8-9]。

1.1外泌體內容物及miRNA 目前，外泌體的內容物成分分析主要通過高通量技術進行，其測序數據被收錄于exoRBase、EVpedia、Vesiclepedia以及ExoCarta等生物信息數據庫中。外泌體外周由雙分子脂質膜包裹，內部包含有蛋白質、脂質、短肽鏈、信使RNA、miRNA、長鏈非編碼RNA等，這些成分與其來源的細胞和自身狀態密切相關[10]。在這些功能性分子中，蛋白質所占比例最高，可大致分為兩類：①外泌體通用的涉及膜轉運、融合及信號轉導等的相關蛋白(如GTPases蛋白、膜聯蛋白、脂筏標記蛋白等)、分子伴侶熱激蛋白70、熱激蛋白90和組織相容性體Ⅱ類抗原呈遞分子，甚至是胞內信號通路蛋白(如Wnt通路相關蛋白)等[11]；②具有特殊細胞來源的蛋白，如腫瘤細胞分泌的外泌體中存在的轉化生長因子-β、凋亡相關因子配體等[12]。此外，核酸成分也是內容物之一，如環狀RNA在結直腸癌患者血清中被發現，且表達豐度上調[13]，一部分miRNA已被證實在腫瘤患者中存在差異表達[6]，可能成為潛在的診斷標志物。

miRNA是一種含有22個核苷酸的非編碼RNA，主要靶向調控信使RNA的轉錄后沉默。據統計，超過50%的蛋白質編碼基因受哺乳動物基因組中的miRNA調節，幾乎涉及所有生物學過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、免疫微環境以及細胞周期調控等[14-16]。非編碼RNA在體內受到精準的調控，通常在發揮生物學效應后核酸分子即被降解，但miRNA可穩定存在于外泌體中并被轉運至全身各處發揮生物學作用，其未被降解的原因可能由于部分miRNA與蛋白形成了復合物[17]。

1.2外泌體及miRNA的作用機制 外泌體廣泛存在于體液循環中，通過旁分泌或內分泌將功能性分子運送至全身各處的受體細胞，參與機體生理病理過程。早在1996年就有研究者發現，EB病毒轉化后的B淋巴細胞可產生具有免疫促進作用的外泌體[18]。有學者發現，結腸癌細胞來源的外泌體質膜上表達熱激蛋白70，可增強自然殺傷細胞的活性，并誘導靶細胞凋亡，包括誘導巨噬細胞釋放促炎細胞因子和腫瘤壞死因子[19-21]。此外，含組織相容性體Ⅱ類分子的外泌體可刺激成熟的樹突狀細胞的免疫活性[22]。然而，Wen等[23]發現，乳腺腫瘤細胞來源的外泌體可直接抑制T淋巴細胞增殖和自然殺傷細胞的細胞毒性，而癌細胞的轉移過程需要外泌體參與建立一個轉移前微環境，使靶點細胞緩解變為易于腫瘤發生的環境，并最終導致免疫逃逸，值得注意的是，外泌體介導的轉移過程在轉移灶細胞膜上均存在特異性的靶點，這一發現為以外泌體為載體的靶向治療提供了新思路。除影響機體免疫系統外，腫瘤來源的外泌體還可通過內分泌、旁分泌甚至自分泌方式轉運效應分子，并調節受體細胞的基因表達，在腫瘤的進展、轉移以及耐藥中起關鍵作用[24]。有學者發現，過表達miR-375可能靶向磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路或靶向凋亡抑制因子5等誘導細胞凋亡，最終抑制結腸癌細胞增殖[25]。Zaharie等[26]進一步研究發現，外泌體攜帶的miR-375可介導酪氨酸激酶2/信號轉導及轉錄激活因子3通路，下調B細胞淋巴瘤/白血病-2和轉錄因子Twist1的表達，抑制腫瘤侵襲。腫瘤相關成纖維細胞是在腫瘤進展中起主導作用的關鍵基質細胞。Bhome等[27]在結腸癌細胞株中發現了miR-21的表達缺失，但卻在外泌體中富集，通過建立過表達miR-21的成纖維細胞與結腸癌細胞的原位移植瘤模型，導致結腸癌肝轉移增加，而外泌體即基質成纖維細胞與腫瘤細胞之間miR-21的載體。

2 外泌體miRNA與結直腸癌的診斷

目前，結直腸癌診斷主要依靠肛門指診、影像學、結腸鏡及鏡下活檢后病理診斷確診，而通常獲取樣本需要侵入性手段，因此常受到各種因素的限制，且無法對腫瘤進展進行連續監測。同時，結直腸癌發病隱匿，早期癥狀不明顯，患者就診時多已為晚期?？梢姡Y直腸癌的早期特征診斷技術亟待提高。無創的液體活檢技術可在多個時間段重復取樣，其中針對外泌體miRNA的分析技術具有巨大的潛力[28]。

2.1外泌體miRNA表達譜在腫瘤發展不同時期的表達差異 在早期的研究中，科學家對多個腫瘤樣本進行miRNA系統的表達分析發現，與信使RNA相比，miRNA可更加精準反映腫瘤的發育譜系和分化狀態，且miRNA表達譜可區分一部分腫瘤在病理學上難以定義的分化類型[29]。由于miRNA可攜帶重要的遺傳學信息，因此針對結腸腫瘤細胞所分泌的外泌體與正常細胞分泌的外泌體之間存在的異質性，分析結直腸癌患者血清中外泌體的miRNA有助于診斷結直腸癌。Ogata-Kawata等[4]利用微陣列分析試驗組(88例結腸癌患者)和對照組(11例正常人)患者血清中外泌體miRNA的表達，結果發現7種miRNA(let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a)在腫瘤發生的早期表達顯著上調，這一結果在結腸癌細胞株中同樣得到了驗證。基于此發現，有研究者指出，miR-125a-3p、miR-4772-3p亦可作為早期結直腸癌診斷的標志物之一[30-31]。此外，Zhao等[32]對miRNA檢測方式進行了改良，與直接從血清中提取miRNA相比，先從血清中分離外泌體，再從外泌體中提取miRNA的方式可以提高miRNA的穩定性和完整性；進一步結合逆轉錄-聚合酶鏈反應證實，miR-21水平在結直腸癌首次診療前已顯著升高，因此miR-21被認為是結直腸癌早期診斷中最具潛力的分子標志物之一。但miR-21的差異表達似乎并不具有特異性，在肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤甚至炎癥反應中均可發現miR-21的表達水平升高，這也是許多其他外泌體miRNA標志物在臨床檢測應用中遭遇的瓶頸[33-36]。

不僅存在于腫瘤發生的早期，外泌體存在于整個腫瘤生長、侵襲的過程[37]。Matsumura等[38]利用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測124例結直腸癌患者的血清樣本發現，外泌體中miR-17-92a的表達水平與結直腸癌復發有密切關系；同時，該樣本中TNM分期越晚的結直腸癌患者miR-19a表達的豐度越高，提示更差的預后，表明miR-19a可作為患者總生存期的獨立預測因子。這一發現對結直腸癌的診斷、評估預后意義重大。在進展期結直腸癌患者中，下調穹隆體主蛋白相關基因后，miR-193a在血清外泌體中富集，且濃度與結直腸癌進展程度呈正相關；另外，miR-193a還可靶向Caprin1蛋白，誘導Ccnd2和c-Myc表達上調，導致細胞在G1期增殖抑制[39]。除miR-193a外，miR-217也是臨床Ⅲ/Ⅳ期結直腸癌潛在的診斷、預后生物學靶點。肝轉移是結直腸癌的常見轉移途徑，也是影響患者生存率的重要因素之一，及時評估是否存在肝轉移對于指導結直腸癌診治方案具有重大意義。研究顯示，血清外泌體中miR-638、miR-29均可提示肝轉移風險和更差的預后[40-42]。

針對外泌體miRNA的研究已深入到多種腫瘤中，而腫瘤細胞外泌體miRNA的表達豐度有顯著差異。利用這一特點，在早期診斷較為困難的結直腸患者中，外泌體miRNA作為診斷標志物的價值仍有巨大發掘空間。雖然目前多種商用檢測試劑盒已經在推廣測試中，但尚未有權威機構批準的、基于外泌體miRNA對于結直腸癌臨床診斷、治療或預后的臨床試驗，其檢測方式也仍未有統一標準。

2.2外泌體miRNA豐度與腫瘤相關基因突變的關系 結直腸癌進展是一個多基因、多因素的過程。p53基因突變參與了人類大多數癌癥的發病機制，功能獲得性的p53蛋白主要通過與其他細胞信號蛋白的相互作用干擾細胞代謝，并誘發腫瘤脅迫的微環境[43]。腫瘤相關巨噬細胞被認為是實體瘤的標志之一，并與腫瘤預后密切相關[44]。在結直腸癌中，攜帶p53基因突變的腫瘤細胞與腫瘤相關巨噬細胞之間的“溝通橋梁”正是由癌細胞選擇性釋放的富含miR-1246的外泌體，誘導巨噬細胞表達為腫瘤支持和抗炎狀態，并在腫瘤微環境中增加轉化生長因子-β的活性，導致腫瘤細胞的增殖和轉移[45]。

結直腸癌患者中有30%～40%存在KRAS(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突變[46]。與正常及腺瘤組織相比，腫瘤患者中KRAS基因突變率更高，因此KRAS基因突變被認為是腫瘤早期形成的誘導因素之一，同時KRAS基因突變也是預后不佳的指標[47]。雖然人們已經較為深入地研究了KRAS基因突變對于結直腸癌細胞行為的影響，但其非細胞自主作用目前尚不明確。Demory Beckler等[48]的早期報道顯示，與KRAS野生型純化的外泌體相比，由表達KRAS突變的結直腸癌細胞中分離的外泌體含有更多的促腫瘤蛋白(KRAS、表皮生長因子受體、Src家族激酶和整聯蛋白等)，可促進受體細胞的生長和侵襲性。有報道指出，胞內KRAS蛋白豐度受miR-146a調控，且miR-146a是結直腸癌干細胞外泌體miRNA的主要成分，其分泌過程受β聯蛋白/T細胞因子-4活化的RAB27B表達調控；同時，患者血清中檢測到高豐度的外泌體miR-146a，且誘導腫瘤過濾性CD66+的中性粒細胞數量增加，而腫瘤浸潤性CD8+的T淋巴細胞數量減少，間接促進了抑制性免疫微環境的形成[49]。

精準醫療是腫瘤治療未來的發展趨勢，這一治療理念是基于對基因層面的深入分析后對患者進行個性化的精準治療。結直腸癌的發生、發展與多種基因序列的改變密切相關，在多種新型治療策略(如免疫治療)中具有高突變負荷的亞型患者獲益更多[50-51]。外泌體miRNA在一定程度上可反映特定的基因突變現象，且可在非侵入性操作下盡早獲得靶點基因相關的miRNA豐度水平，通過推測可能出現的基因型改變，使結直腸癌患者在早期診療中獲益。

2.3外泌體miRNA與上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 有研究證實，賴氨酸特異性去甲基酶1、上皮鈣黏素等異常表達與結直腸癌侵襲轉移過程密切相關[52]。進一步研究證實，賴氨酸特異性去甲基酶1是EMT過程的重要環節，而EMT的逆轉過程中，間充質-上皮轉化在癌細胞侵襲轉移中發揮作用[53]。EMT和間充質-上皮轉化發生機制復雜，細胞間交互作用廣泛，外泌體的參與也是其中重要的一環。有學者發現，發生EMT的HCT-8結腸癌細胞株，其轉移細胞對氟尿嘧啶等化療敏感性降低，使用電子顯微鏡觀察可見HCT-8細胞可分泌外泌體且被轉移細胞攝??；與細胞內水平相比，外泌體中miR-210豐度顯著上調，因此miR-210可能是EMT的始動因子，并引導轉移細胞至新的轉移位點[54]。另有研究指出，miR-210可通過靶向液泡膜蛋白1在缺氧環境下誘導結直腸癌細胞侵襲轉移，是提示腫瘤預后的獨立預測因子[55]。

在胃腸道腫瘤中，有關外泌體miRNA與EMT的相關研究尚不多見，結直腸癌腫瘤患者中外泌體miRNA直接參與EMT相關過程的研究報道較少。但有研究表明，外泌體參與EMT信號轉導，促進腫瘤細胞侵襲，導致腹膜擴散而預后不良；進一步對化療后的患者腹水樣本進行高通量測序，鑒定出29個外泌體miRNA與治療前有差異表達，在治療中可用于抑制腹膜轉移[56]。此外，在肺癌[57]、前列腺癌[58]、早期肝癌[59]中的研究已有外泌體miRNA診斷價值的報道，可能為結直腸癌的研究提供思路。

3 小 結

傳統的診斷方式很難使結直腸癌的早期診斷率實現質的提升，但液體活檢技術解決了這一不足。目前，已有多個miRNA作為結直腸癌的早期診斷標志物展現出了巨大潛力，且對監測腫瘤轉移、復發等生物學行為亦有益，可幫助臨床工作者更加全面了解患者腫瘤進展，并制訂更加精準的個體化治療方案。然而，針對來源復雜的外泌體內容物檢測方法尚存在爭議，對于檢測的靈敏度與準確度、檢測方法、成本高昂等問題尚未有明確的優化方案，外泌體miRNA檢測在臨床中的大規模推廣應用仍受到限制[60]。但在臨床采用外泌體miRNA作為結直腸癌的診斷標志物仍具有巨大潛力。