糖尿病腎臟病中足細胞自噬調控機制的研究進展

韓妙茹，楊康，楊洪濤

(天津中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，天津 300380)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)是腎病終末期的主要病因[1]。臨床中，DKD患者最初表現為微量蛋白尿，隨后發展為大量蛋白尿，腎小球濾過率降低相對較晚，最終進展為終末期腎病。研究發現，約10%的1型或2型糖尿病患者在患糖尿病25年后出現蛋白尿[2]。因此，蛋白尿是一項可以預測腎臟損害的重要指標，其主要是由腎小球濾過膜結構和功能改變引起，而足細胞是腎小球濾過屏障結構和功能正常的重要組成部分，故足細胞損傷是引起大量蛋白尿的原因之一。自噬是一種高度保守的細胞循環過程，其能將蛋白質以及受損的細胞器進行自我降解和重建，對維持細胞內穩態至關重要。研究表明，足細胞是一種高度分化的細胞，有絲分裂后的足細胞具有很高的基礎自噬水平[3]，高糖狀態誘導足細胞自噬功能失調，導致足細胞嚴重受損，進而導致大量蛋白尿。迄今為止，已發現了40多個自噬相關基因(autophagy associated gene，ATG)及通路[4]。研究證實，營養感應信號途徑及胞內應激反應信號所介導的自噬與DKD發病密切相關[5]。現就DKD中足細胞自噬調控機制的研究進展予以綜述，并著重介紹足細胞自噬在DKD中通過營養感知信號途徑和細胞內應激信號的調節作用。

1 營養傳感途徑

營養傳感途徑主要包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)]、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)依賴性組蛋白脫乙酰酶[沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)]三種。當營養過剩時,葡萄糖、氨基酸等營養物質的增加會激活mTOR，從而抑制自噬；當營養和能量缺乏時，AMPK和氧化的NAD依賴性組蛋白脫乙酰酶(SIRT1)被激活，從而促進自噬[5]。因此，mTOR對自噬起負調控作用，AMPK和SIRT1對自噬起正調控作用。

1.1mTOR信號通路 mTOR是DKD中最關鍵的自噬調節因子之一，也是感受細胞外營養、調控蛋白質的合成速率、影響細胞生長的核心。研究發現，mTORC1和mTORC2對雷帕霉素存在敏感性差異[6]。當營養過剩時，mTORC1被激活，并磷酸化ATG13，自噬受到抑制；而在營養和能量缺乏、應激狀態下，mTORC1活性受到抑制，ATG13磷酸化水平降低[7]。去磷酸化的ATG13與ATG1(unc-51樣激酶1)和ATG17(骨架蛋白FIP200)形成復合物，從而啟動自噬[8]。雷帕霉素是一種用于預防器官移植排斥反應的免疫抑制劑，是mTOR信號通路的特異性負調控因子。它可以抑制mTORC1活性，從而誘導自噬，維持細胞穩態[5]。以往研究表明，雷帕霉素可以改善腎小球肥大，系膜擴張、腎小球基膜粘連、腎纖維化，以及DKD患者蛋白尿的發展[9]。在胰島素抵抗條件下，足細胞自噬活性下降，當給予mTOR特異性抑制劑——雷帕霉素治療后，自噬激活，從而減輕胰島素抵抗誘導的足細胞損傷[10]。Inoki等[11]研究發現，在雜合子mTOR的調節相關蛋白敲除小鼠的足細胞中，mTORC1活性被部分抑制，提示mTORC1信號過度激活與足細胞損傷進展密切相關，同時也與糖尿病模型小鼠的蛋白尿相關。可見，mTOR信號通路負性調控足細胞自噬對于DKD的發病機制起重要作用。其中，mTORC1的活性在維持足細胞穩態中至關重要。

1.2AMPK信號通路 AMPK是一種應激激活激酶，是一個重要的細胞能量感應器，主要通過感應AMP與ATP的比例調節細胞的能量狀態。當細胞能量不足時，一方面，AMPK通過結節性硬化復合物1/2-Rheb信號通路或調控其他相關蛋白(如mTOR的調節相關蛋白)磷酸化與mTORC1相互作用，從而抑制mTORC1的活性；另一方面，AMPK可以與絲氨酸317、絲氨酸555和絲氨酸777位點結合并直接激活unc-51樣激酶1，誘導自噬[12]。近年來研究表明，小檗堿具有良好的調節血壓，控制血糖和抗癌，抗炎等功效[13]。小檗堿是一種有效的自噬激活劑，Choi等[14]研究發現，小檗堿可以減輕高糖誘導的mTOR激活，增強AMPK活化，誘導自噬，從而減輕高糖誘導的足細胞損傷。在糖尿病小鼠的足細胞中，磷酸化的AMPK水平較低，而二甲雙胍可以增強AMPK磷酸化，降低mTOR活性，從而改善高糖誘導的足細胞損傷[15]。

1.3SIRT1信號通路 SIRT1是一種高度保守的NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，作為一種細胞內營養感應器，其通過檢測NAD+水平調節細胞代謝及氧化還原狀態。研究表明，SIRT1在DKD的進展中發揮了重要作用[16]，當細胞內能量缺乏時，AMPK被激活，NAD+水平升高，激活SIRT1活性。一旦被激活，SIRT1脫乙酰化ATG，如ATG5、ATG7等；同時，SIRT1還可以將叉頭轉錄因子脫乙酰化，從而調控自噬下游相關通路[17]。Chuang等[16]觀察發現，在高糖刺激下，具有廣泛SIRT1基因敲除的糖尿病小鼠表現出DKD的早期特征，且足細胞特異性SIRT1基因缺失可加重糖尿病db/db小鼠的蛋白尿。因此，在足細胞的穩態維持中SIRT1發揮了重要作用。Hong等[18]研究發現，SIRT1過表達可有效緩解糖尿病ove26小鼠(胰島β細胞上鈣調蛋白基因超表達，從而導致胰島素缺乏并產生1型糖尿病的一種小鼠)的蛋白尿及腎損傷。研究證明，SIRT1可將轉錄因子p65去乙酰化發揮生物學作用，在db/db小鼠中，足細胞特異性的SIRT1基因敲除導致p65乙酰化水平升高，從而抑制核因子κB信號通路，SIRT1是核因子κB的一種關鍵抑制劑，其在糖尿病腎臟炎癥調節中發揮關鍵作用[19]。

2 細胞內應激

2.1氧化應激 研究表明，活性氧類(reactive oxygen species，ROS)是激活自噬的最常見因子[20]。在高糖狀態下，細胞呼吸功能失調會產生大量的超氧化物(超氧陰離子自由基)，以及其他ROS，為了繼續維持細胞穩態，哺乳動物會產生抗氧化酶和非酶物質，包括過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和硫氧還蛋白等[21]。它們可以對抗ROS引起的細胞損傷。當生成的ROS與抗氧化酶調節失衡時，細胞出現氧化損傷。研究表明，ROS的增加可激活蛋白激酶R樣內質網激酶，隨后磷酸化真核細胞起始因子2α，激活ATG4，加速可溶性微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ型的形成，并抑制mTORC1活性，從而誘導自噬[20]。雖然足細胞自噬與氧化應激的作用尚未被完全闡明，但有證據表明高糖誘導了足細胞自噬，同時高糖能促進足細胞產生ROS，而抗氧化劑可以抑制高糖誘導的自噬[22]。因此，ROS在高糖誘導的足細胞自噬中具有重要作用。Zhan等[23]研究發現高糖條件下，足細胞發生氧化應激和炎癥反應，而雷公藤紅素可通過恢復血紅素加氧酶-1介導的自噬途徑，保護高糖狀態下的足細胞損傷。腎素-血管緊張素-醛固酮系統活性升高是慢性腎臟病進展的一個重要原因。足細胞是醛固酮的靶標之一，Bai等[24]發現，ROS誘導的足細胞自噬可以顯著抵消醛固酮誘導的足細胞損傷，抑制ROS的產生，對醛固酮誘導的足細胞損傷具有保護作用，因此ROS在足細胞自噬形成中起關鍵作用。

2.2內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS) 近年的研究表明，ERS可以參與多種腎臟疾病，可誘導足細胞結構和功能障礙，進而導致腎小球硬化[25]。內質網主要參與蛋白質的合成、修飾與加工。因此，ERS指在某些情況下，出現錯誤蛋白或未折疊蛋白堆積的生理或病理狀態，這被稱作未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。UPR主要由蛋白激酶R樣內質網激酶、活化轉錄因子6、肌醇依賴酶1三個分支組成。在特定環境下，三個分支均可以調節細胞自噬[5]。其中，肌醇依賴酶1α通過與凋亡信號調節蛋白1/c-Jun氨基端激酶信號通路相互作用，磷酸化Bcl-2，導致Bcl-2與Beclin-1(酵母ATG6的同系物)解離，激活Beclin-1和磷脂酰肌醇-3-羥激酶復合物，從而誘導自噬。蛋白激酶R樣內質網激酶、活化轉錄因子6可以上調ATG3、ATG12、ATG5等自噬基因的表達，從而促進自噬。在足細胞中，糖尿病環境下的代謝變化會擾亂UPR、自噬以及mTOR信號通路的平衡狀態[26]。此外，非酯化脂肪酸、高血糖[27]、胰島素信號缺陷[28]均可誘導ERS。而研究證明，UPR的調節劑牛磺熊脫氧膽酸可以治療鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠，減輕高糖誘導的足細胞損傷和蛋白尿，改善組織病理學損害[3]。UPR的激活既觸發了C/EBP同源蛋白依賴的細胞凋亡，又觸發了自噬來應對損傷。Wang等[29]在輕度2型糖尿病和高血壓聯合的動物模型中，使用ERS抑制劑(牛磺熊脫氧膽酸)降低了血壓，改善了腎功能，提示高血糖與高血壓共同增加ERS，擴大腎損傷，而抑制ERS可以明顯減輕糖尿病高血壓腎病的腎損傷。因此，糖尿病和高血壓可以通過ERS協同作用促進腎損傷。在糖尿病db/db小鼠中，應用牛磺熊脫氧膽酸治療后，持續的高糖導致的足細胞自噬缺陷被明顯糾正[30]。上述研究表明，ERS和足細胞自噬在DKD的發生發展中起重要作用。

2.3低氧應激 缺氧是DKD進展的一個重要事件，研究表明，缺氧是公認的一種腎臟發病途徑[31]。缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)家族在器官組織缺氧的調節中發揮重要作用，其家族成員主要有HIF-1、HIF-2、HIF-3三種轉錄因子，其中HIF-1是細胞適應氧濃度變化的主要調控因子[32]，包括HIF-1α和HIF-1β。以往的研究顯示，HIF-1α在缺氧條件下的足細胞中顯著增加[33]。在缺氧條件下，HIF-1α被激活，上調腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3的表達，當腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3表達水平升高時，Beclin-1從Bcl-2/的抑制作用中解離出來，與多種蛋白質相互作用形成Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-羥激酶復合物，引導自噬體的形成[34]。Bohuslavova等[35]在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中發現，在DKD早期，HIF-1α缺乏會影響足細胞存活，導致糖尿病腎小球損傷，提示HIF-1信號受損會加速足細胞丟失及其維持腎小球濾過屏障的能力，從而加速DKD進展。因此，HIF-1在預防糖尿病引起的組織損傷的早期反應中起重要作用。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是HIF-1α最有代表性的下游調控因子，其主要由足細胞合成，是血管生成的促成劑[20]。研究表明，VEGF過表達可增加腎小球的血流量和通透性，導致足細胞損傷，其結果可能最終導致腎小球硬化，因此血清VEGF水平可作為慢性腎臟疾病進展的預測因素之一[36]。Miaomiao等[37]在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠足細胞中發現，高糖可引起足細胞足突消失和VEGF上調。用自噬誘導劑雷帕霉素治療后，VEGF的活化被顯著消除，足細胞損傷得到改善；而用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤處理的足細胞的VEGF表達增加，表明自噬在調節VEGF中起重要作用。以上研究證明，足細胞自噬與HIF-1α/VEGF有一定的聯系，需進一步探索。

3 其他相關信號通路

目前，DKD中足細胞自噬相關信號通路仍在研究中。除上述營養傳感途徑與細胞內應激信號外，以往的研究表明，ATG12-ATG5共軛體系在足細胞自噬中也起了關鍵作用，它通過促進自噬小體的產生，激活足細胞自噬[38]。β-抑制蛋白(β-arrestins，ARRBs)是一種多功能蛋白，研究表明，沉默ARRB1或ARRB2基因可以恢復高糖狀態下降低的ATG12-ATG5水平，促進自噬。而ARRB1/2和ATG7之間的相互作用增強，可能會阻止ATG7激活ATG12的甘氨酸殘基，從而減少ATG12-ATG5的結合并抑制自噬，加重DKD狀態下的足細胞損傷[38]。Ji等[39]研究表明，縫隙連接蛋白43的表達增加可以激活DKD中的mTOR信號通路，抑制足細胞自噬，而抑制縫隙連接蛋白43表達，可以激活足細胞自噬，減少足細胞損傷。長鏈非編碼RNA在DKD的發病中也扮演重要角色，學者發現在鏈脲佐菌素誘導的DKD小鼠中，長鏈非編碼RNA肺腺癌轉移相關轉錄本1的功能失調，并參與高糖誘導的足細胞損傷，從而加速DKD的進展[40-41]。因此，肺腺癌轉移相關轉錄本1在糖尿病足細胞損傷和蛋白尿中起關鍵作用。研究表明，長鏈非編碼RNA-SOX2重疊轉錄本通過刺激miR-9促進SIRT1基因的表達，從而誘導受損的足細胞自噬，減輕足細胞損傷[41]。以上研究表明在DKD狀態下，完整的自噬通路在維持足細胞穩態中起重要作用，自噬功能失調，導致足細胞損傷，進而導致DKD患者產生大量蛋白尿，最終導致DKD進展為終末期腎病。

4 小 結

隨著多種強化治療方案的應用，糖尿病的發病率在世界范圍內仍呈上升趨勢。DKD作為一種嚴重的糖尿病并發癥，發病率和死亡率居高不下，因此迫切需要尋找預防和治療DKD的其他有效治療靶點。雖然DKD的發病機制尚未完全清楚，但是足細胞自噬中的主要營養感應信號途徑以及細胞內應激信號在DKD中有重要的調節作用。因此，足細胞自噬的調控機制需要進一步探索，以期為臨床預防和治療糖尿病并發癥提供新的治療靶點。