TGR5受體介導的信號轉導通路的研究進展

祁有朝，李培鋒

(內蒙古農業大學獸醫學院,農業部動物臨床診療技術重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018)

G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是位于細胞膜上龐大的受體家族，介導多種信號轉導通路，參與機體的生理和病理活動。GPCRs具有相同的七次跨膜結構域，一旦細胞外的配體(藥物、激素、脂質)在細胞膜上特定的結合位點與GPCRs相互作用，就會轉導細胞外的信號到細胞內，發生一系列的級聯放大反應，調節許多不同的信號轉導途徑，從而在機體的神經疾病、脂肪代謝、急性和慢性炎癥以及癌癥干預和治療等方面發揮了重要的作用[1]，因為不同的GPCRs具有不同的功能，因此成為了許多疾病研究的作用靶點。

TGR5受體作為GPCRs一員，也稱為M-BAR或GPCBAR1，于2002年在研究代謝方面的實驗時首次發現了TGR5受體，也是發現的第二個膽汁酸受體，TGR5受體具有七次螺旋跨膜結構域，屬于典型的GPCRs家族成員。TGR5受體在人和動物體內廣泛地表達，如胎盤、心臟、脾臟、骨骼肌、腎、肝、小腸、肺和外周血白細胞、神經細胞等，其中TGR5 mRNA的表達在肺、胎盤和脾臟非常高。研究發現，TGR5受體可以被膽汁酸以及TGR5特異性激動劑INT-777激活，發生內陷反應以介導第二信使環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的產生[2]；同時，活化的TGR5受體可以介導許多重要的信號轉導通路，如轉錄交換因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)，細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和信號轉導以轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。

1 TGR5與AKT信號通路

AKT也稱作蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，參與細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期等生理和生化過程。TGR5受體通過細胞膜上的Gs蛋白將細胞外的信號轉移到細胞內，在磷脂酰肌醇3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)催化下，3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PI(3,4,5)P3]生成3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate，PI(3,4)P2]和4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol 4,5-triphosphate， PI(4,5)P3]，其中PIP3作為第二信使與AKT蛋白在蘇氨酸殘基308處發生磷酸化反應，激活AKT蛋白；AKT蛋白也可以在絲氨酸殘基473位點處發生磷酸化反應。磷酸化的AKT可以增加泛素蛋白連接酶MDM2蛋白的表達，從而抑制p53蛋白表達，參與DNA損傷修復以及調控細胞周期；此外，磷酸化AKT能夠抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(圖1)。在牛主動脈上皮細胞中，牛黃石膽酸(taurine bile acid，TLCA)激活TGR5蛋白介導PIP3-AKT信號通路，磷酸化的AKT蛋白降低了一氧化氮(nitric oxide，NO)的產生[3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是已知的AKT下游蛋白，參與蛋白質的翻譯過程，促進蛋白質的合成。當藥物或激素與TGR5受體相結合，細胞外的信號通過AKT向mTORC1傳遞，有活性的mTOR蛋白復合物1(mTOR complex 1，mTORC1)進一步磷酸化4E-BP1(4E-binding protein 1，4E-BP1)和p70 S6激酶，影響mRNA翻譯水平，從而發揮一系列的生物學效應，如激活轉錄，促進線粒體代謝和脂肪代謝；與對照組小鼠比較，發現mTORC1 基因敲除的小鼠的體型變大，許多器官如心臟、胰腺也隨之變大且伴有脂肪組織[4]；然而，mTOR蛋白復合物2(mTOR complex 2，mTORC2)的磷酸化激活AKT1蛋白的表達，AKT1通過FoxC2抑制脂肪細胞的分化，從而抑制了肥胖[5]，這說明mTOR蛋白復合物(mTOR complexs，mTORCs)與代謝有關，且直接參與脂肪代謝。在巨噬細胞中，TGR5受體的激活通過AKT-mTOR信號通路降低趨化因子的表達，從而抑制炎癥反應。

Fig 1 AKT signaling pathway induced by TGR5

2 TGR5與NF-κB信號通路

NF-κB蛋白家族是一種多效性的轉錄因子，可以與多種細胞啟動子上的NF-κB位點相互作用，發生特異性結合從而啟動轉錄的發生。NF-κB家族成員包括：NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、p65(RelA)、c-Rel(Rel)、RelB等。NF-κB家族蛋白與IκB蛋白(IκBα,、IκBβ、IκBγ、BCL3、IκBε、P50、P100)相結合在胞漿內處于靜息狀態，IKK激酶可以特異性的激活IκBα,、IκBβ，使NF-κB蛋白與IκB蛋白分離，從而激活NF-κB介導的信號通路，參與機體的抗炎免疫活動(圖2)。在小鼠急性神經炎疾病中，牛黃熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)激活TGR5受體介導的抑制小膠質細胞分泌干擾素γ(interferon γ，INF γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等促炎性因子，從而發揮抗炎作用[6]；在CD14+巨噬細胞中，石膽酸(lithocholicacid，LCA)和去氧膽酸(eoxycholic acid，DCA)可以通過TGR5激活c-Fos，c-Fos調節NF-κB p65蛋白的激活，抑制TNF-α、白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)的分泌[7]。TGR5通過負反饋調節NF-κB以應答肝臟炎癥反應，這主要是TGR5通過抑制IκBα的磷酸化，P65核移位以及NF-κB DNA結合活性以及轉錄活性，發揮了抗炎調節作用。Plos等[8]研究發現，在巨噬細胞中，TGR5受體被INT-777激活抑制P65的核移位和IκBα的磷酸化發揮抗炎作用。

Fig 2 NF-κB signaling pathway induced by TGR5

3 TGR5與ERK信號通路

ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，參與許多機體的生理反應，如細胞生存、細胞分化、細胞凋亡、細胞增殖。最近的研究發現，在野生型小鼠模型中，TGR5激動劑INT-777可以通過增加活性氧和原癌基因的表達介導膽管上皮細胞的增殖，非受體酪氨酸激酶(nonreceptor tyrosine kinase，cSrc)介導表皮生長因子反式激活以及ERK1/2的磷酸化。在非纖毛膽管細胞中，激活的TGR5受體可以顯著性抑制ERK1/2蛋白的表達，從而促進細胞的增殖；在纖毛膽管細胞中，TGR5受體的激活顯著性的抑制了cAMP的產生，促進ERK1/2蛋白的磷酸化水平[9](圖3)，說明在非纖毛膽管細胞中，激動劑與TGR5相互作用，激活了Gs蛋白，增加了cAMP水平；在纖毛膽管細胞中，激動劑與TGR5相互作用，激活了Gi蛋白，從而抑制了cAMP水平的增加，促進了ERK1/2蛋白的表達，從而抑制細胞的增殖[10]。Laura等[11]在TGR5-/-和TGR5+/+的肥胖小鼠中發現，膽汁酸模擬物在TGR5+/+的小鼠中激活AKT蛋白表達促進ERK1/2的磷酸化水平，誘導線粒體的分裂，促進線粒體呼吸，從而增加了白色脂肪的消耗，與TGR5-/-肥胖小鼠相比較，TGR5+/+小鼠體脂含量下降，體型變小，說明TGR5受體可以介導ERK信號通路，參與機體的凋亡、增殖以及分化等生命活動。

Fig 3 ERK signaling pathway induced by TGR5

4 TGR5與STAT3信號通路

STAT3是一類由人類基因STAT3編碼的轉錄因子，STAT3是STAT蛋白家族的只要成員之一，受到細胞因子和生長因子雙重調節作用，STAT3可以被ERK激酶激活，形成同源或異源二聚體，進一步進入細胞核，啟動轉錄。作為一個轉錄因子，STAT3參與許多機體的生理活動，如免疫應答、生長、凋亡、新陳代謝、炎癥反應等。機體在病原入侵的情況下，STAT3處于過表達水平，如直腸癌、胸腺癌、皮膚癌、肺癌、胃癌、骨癌等[12]。在過表達TGR5基因的A549細胞系中，STAT3活性顯著的降低，促進了凋亡基因Bcl-xL的表達以及抑制促血管生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，控制了癌細胞的生長與分化[13]；同時，在RNA干擾(RNA interfere，RNAi)TGR5的胃癌細胞中，STAT3的磷酸化通過抑制凋亡蛋白體Bcl-xL和Cyclin D1抑制癌細胞的凋亡和促進癌細胞增殖[14]，這說明TGR5受體對癌細胞的調節作用與STAT3的表達有關(圖4)。在肺癌細胞中，TGR5受體激活顯著性的抑制了STAT3的磷酸化反應，從而降低了TNF-a誘導的炎癥基因TNF-α、白細胞介素-8(interleukin 8，IL-8)、環氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)的表達[15]，抑制了炎癥的發生和發展。所以，在胃癌和肺癌的治療中，TGR5受體將成為一個藥物治療的潛在靶點。

Fig 4 STAT3 signaling pathway induced by TGR5

5 TGR5與cAMP信號通路

cAMP作為一個經典的第二信使，參與機體的所有生理和病理活動。當細胞受到應激或胞外一些配體的刺激，就會使細胞膜上受體的構象發生變化，是細胞膜受體從無活性狀態變為激活狀態，進一步激活膜上的Gs蛋白，激活的Gs蛋白進一步激活細胞內的腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)，催化ATP形成cAMP和焦磷酸(pyrophosphoric acid，PPi)，cAMP可以使蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)發生磷酸化，磷酸化的PKA進一步激活下游的cAMP反應結合元件(cAMP response binding element，CREB)，磷酸化的CREB發生核移位進入細胞核，從而調節細胞的反應(圖5)。我們研究發現，在大鼠肺泡巨噬細胞中，TCDCA可以激活TGR5受體，增加cAMP含量，從而使PKA和CREB蛋白發生磷酸化，極顯著的降低由LPS引起的細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及COX2的分泌和表達[16]。在TGR5基因敲除小鼠中，cAMP、PKA、CREB的表達顯著的低于野生型小鼠[17]，說明TGR5受體可以介導cAMP信號通路。Rajagopal等[18]用齊墩果酸(oleanolic acid，OA)研究胃腸道平滑肌時發現，在野生型(wild type，WT)小鼠上，OA通過激活Gαs蛋白，增加cAMP水平，激活PKA激酶磷酸化，抑制RhoA/Roh激酶，從而引起胃腸道平滑肌細胞舒張；然而，OA作用TGR5-/-小鼠不能引起胃腸道平滑肌舒張。說明TGR5受體通過cAMP介導的信號通路參與機體的生理活動。

Fig 5 cAMP signaling pathway induced by TGR5

6 TGR5受體介導的信號轉導通路的研究方法

膽汁作為一種傳統的中藥，在《內經》中有記載：“肝之余氣，溢入于膽，聚而成精。由內藏精而不泄，外視物而得明為清凈之腑，能通于眼目”，說明膽汁對于人體的健康具有治療作用[19]。膽汁酸作為膽汁的有效成分之一，與西藥相比較對肝、腎、肺等器官的毒副作用較小，在生理學和病理學方面發揮了重要的作用，如膽汁酸可以通過膽汁酸受體TGR5介導cAMP-PKA-CREB發揮抗炎免疫調節作用，抑制促炎因子的分泌；在大鼠巨噬細胞中，TCDCA可以通過TGR5受體介導PKC-JNK/p38-p53信號轉導通路提高細胞的凋亡率[20]，p53作為典型的癌基因，參與癌癥的發生和發展，因此，綜述TGR5受體介導的信號通路的研究方法，對于膽汁酸在疾病治療機理方面尤為重要。2003年，日本學者Kawamata等[21]用牛黃石膽酸(taurine-conjugated lithocholic，TLCA)作用于TGR5-GFP載體過表達穩定中國倉鼠卵巢細胞系(Chinese hamster ovary cells，CHO)，通過倒置熒光顯微鏡觀察發現TLCA可以使TGR5受體發生內陷反應并且激活Gαs蛋白的表達；同時，用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測發現，活化的Gαs蛋白可以通過AC的催化作用增加第二信使cAMP的水平。劉倩等[22]用共聚焦顯微鏡清楚地觀察到過表達TGR5的NR8383細胞發生內陷反應，并且用ELISA方法檢測到cAMP含量顯著性的增加，這一結果與Kawamata等[21]的研究結果相一致，提示膽汁酸可以與TGR5相互作用。cAMP作為第二信使可以介導PKA-CREB信號通路參與抗炎免疫調節以及葡萄糖代謝等。牛黃熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)以劑量依賴性的方式促進胰腺β細胞分泌胰島素，研究發現這與cAMP-PKA-CREB信號通路介導有關；用G蛋白亞單位受體特異性抑制劑NF449培養胰腺β細胞，再用TUDCA作用細胞，采用Western blot檢測發現Gαs蛋白表達降低；然而，在TGR5特異性激動劑INT-777作用的胰腺β細胞中發現Gαs蛋白表達增加，且ELISA檢測結果表明cAMP的含量也顯著性的增加，提示TUDCA可以激活TGR5受體，增加cAMP含量；進一步的使用PKA特異性抑制劑H89培養胰腺β細胞，再用TUDCA作用細胞，用Western blot檢測PKA以及CREB磷酸化水平，發現TCDCA在H89的作用下不能增加PKA以及CREB磷酸化，且胰島素的分泌也毫無變化，提示TUDCA通過cAMP-PKA-CREB信號通路調節胰腺β細胞分泌胰島素[23]。同樣的，作者也使用抑制劑，研究TCDCA對抗炎免疫體調節作用的影響，發現TCDCA可以通過cAMP-PKA-CREB抑制免疫細胞中TNF-α、IL-1β以及IL-6基因和蛋白的表達，提示TCDCA通過TGR5受體介導cAMP-PKA-CREB信號通路發揮抗炎作用。綜上所述，TGR5信號通路的研究方法為TGR5介導的信號通路在疾病的研究提供了理論基礎以及治療靶點。

7 展望

目前，世界上各種各樣的疾病越來越多，對人類的生命造成了巨大的危害，新藥的研發迫在眉睫，尤其是在癌癥方面的有效藥物非常少；其次，膽汁淤積也會導致動脈粥樣硬化以及癌變[24]。TGR5受體作為GPCRs家族中的一員，由于在人類和動物體內廣泛的表達，參與機體的許多生理和病理活動。TGR5受體通過介導AKT、NF-κB、ERK、STAT3以及cAMP信號通路調節參與機體的抗炎免疫調節、葡萄糖代謝、能力代謝、脂質代謝等。當今，癌癥的免疫治療研究在當今越來越火熱，以程序性細胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1，PD-1)抑制劑和嵌合抗原受體 T 細胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)療法為代表的免疫療法在各種癌癥特別是黑色素瘤方面取得了不錯的成就[25]；然而，事實已經證明，TGR5受體可以通過STAT3信號通路來干預和治療癌癥的發生和發展，在此大膽假設，TGR5受體是否與PD-1和PD-L1之間具有一定的聯系，能否對癌癥的研究提供新的思路，TGR5受體是否成為新的癌癥治療靶點，期待在未來有更多的研究成果；同時，通過綜述TGR5介導的相關信號通路以及研究方法，旨在為膽汁酸以及和膽汁酸具有相同結構的新藥研發提供研究思路和方法。