Swiprosin-1/EFhd2調控免疫炎癥反應的研究進展

馮美霞，蘇 笠，王志斌，張立超

(1. 上海市中醫醫院藥劑科，上海 200071；2. 上海大學轉化醫學研究院，上海 200444；3. 第二軍醫大學藥學系，上海 200433)

免疫炎癥反應(immuno-inflammatory response)是通過細胞因子激活機體免疫細胞的活化，從而進一步釋放細胞因子的過程。Swiprosin-1又稱EF-hand domain-containing protein D2(EFhd2)，是一種保守的EF手性卷曲螺旋蛋白，主要在淋巴細胞和免疫系統中發揮作用[1]。目前研究發現，EFhd2參與肥大細胞、巨噬細胞和B淋巴細胞等免疫細胞的炎癥因子分泌、遷移和凋亡，以及核轉錄因子κB(NF-κB)、Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK-STAT)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和鈣信號等炎癥信號通路的調節，表明EFhd2具有廣泛的免疫調節潛能。本文主要綜述了EFhd2在調控免疫炎癥反應中的研究進展。

1 EFhd2的結構及表達分布

EFhd2是一種由240個氨基酸組成的鈣銜接蛋白，分子量為27 ku(預測值)和33 ku(表觀值)。通過蛋白質一級結構分析顯示，EFhd2由4個推定的豆蔻酰化位點(脂質修飾)，3個SH3結構域蛋白的結合位點，2個功能性EF手性結構域和C末端卷曲螺旋結構域組成[1-2]。

Fig 1 Protein primary structure patterns of EFhd2[2]

EFhd2最初在人的CD8+T淋巴細胞中被發現[1]，隨后發現其在未成熟的B細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、人外周血單核細胞(PBMC)等其它免疫細胞中也有表達[2-3]。并且，EFhd2廣泛表達于不同物種的組織和細胞中，在腦、肝臟、心臟、脾臟、肺、腎等組織中均有表達。研究還發現，EFhd2在許多病理狀態，如炎癥(急性-被動皮膚過敏和慢性特異性皮炎)、神經退行性疾病、精神分裂癥、膿毒癥、糖尿病腎病及腸球菌感染的男性生殖病等情況下均顯示表達增高[4]，表明EFhd2與免疫和炎癥反應具有一定相關性。

2 EFhd2在免疫炎癥反應中的調節作用

2.1 EFhd2參與免疫細胞的激活目前研究發現，從果蠅到高等生物，EFhd2在小鼠單核巨噬細胞RAW264、人PBMC、小膠質細胞和NK樣細胞中均有表達。并且，EFhd2參與了T細胞晚期活化的蛋白激酶C(PKC)信號通路的表達調節和T細胞誘導的細胞毒性，在肥大細胞活化期間表達上調；促進巨噬細胞凋亡、遷移和炎癥因子的分泌；可作為B細胞脂筏(BCR)相關的銜接蛋白參與鈣離子信號的傳導等，這些結果表明，EFhd2可能作為免疫炎癥反應調控中的潛在靶標。

2.1.1在T細胞中的作用 作為免疫反應的核心參與者，T細胞可通過與靶細胞特異性結合，破壞靶細胞膜直接殺傷靶細胞或釋放淋巴因子使免疫效應擴大和增強。基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)是T細胞的一般趨化因子，并且SDF-1α受體CXCR4在大多數淋巴細胞均存在表達[5]。過表達EFhd2增強了SDF-1α介導Jurkat T細胞在纖粘蛋白上的細胞遷移[5]。但Kim等[6]發現,EFhd2的過表達不參與T細胞抗原受體(T cell receptor，TCR)刺激或細胞內信號激活誘導的T細胞活化，提示其不參與最初的T細胞活化；而使用抗CD3/28抗體刺激Jurkat T細胞6～12 h后，EFhd2 mRNA在T細胞活化期間表達明顯增加，并且其蛋白水平在PMA刺激下以時間依賴方式上調，表明EFhd2可能參與T細胞晚期的PKC信號通路的活化[6]。

程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)是一種典型的共抑制受體，在免疫抑制中通過結合配體PD-LI或PD-L2激活T淋巴細胞。Michael等[7]發現EFhd2與免疫突觸中的PD-1共定位并且可作為PD-1信號轉導的重要介質。通過小干擾RNA(siRNA)干擾人原代T細胞中的EFhd2，幾乎完全消除了PD-1對抗原受體下游IL-2分泌的抑制作用，而敲減EFhd2阻斷了PD-1誘導的細胞外調節蛋白激酶(ERK)去磷酸化。此外，將MC38鼠結腸癌細胞植入EFhd2敲除鼠皮下，與同窩野生型小鼠相比，敲除鼠的細胞毒性降低、細胞中溶解顆粒向免疫突觸極化受損以及腫瘤生長速率增加，表明EFhd2對于T細胞誘導的細胞毒性也是必需的[7]。

2.1.2在肥大細胞中的作用 在體外培養的人肥大細胞HMC-1中，Kim等[8-9]發現，佛波酯對EFhd2有瞬時誘導作用，過表達EFhd2能增強PKA/A23187刺激HMC-1分泌組胺和IL-8，增加IL-8和IL-3 mRNA的表達，而敲減EFhd2可抑制IL-8和IL-3 mRNA表達。此外，他們還通過IgE和人血清白蛋白(DNP-HAS)刺激的FcεRI交聯，以及被動皮膚過敏反應和特應性皮炎的體內組織模型發現RBL-2H3細胞中EFhd2的表達上調。這些結果證明了在炎癥反應中，EFhd2可能作為細胞因子表達和肥大細胞活化的調節劑[8]。

2.1.3在巨噬細胞中的作用 巨噬細胞是抵抗入侵病原體的起始防御線之一，是具有誘導初級免疫應答能力的抗原遞呈細胞。通過釋放各種細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，巨噬細胞可參與調節適應性免疫應答，在重組牛分枝桿菌株(BCG)對人單核細胞系THP-1細胞的刺激下，EFhd2與TNF-α、CD40等一起被明顯上調，增強了免疫刺激活性，改善了THP-1細胞的抗原遞呈能力[10]。此外，THP-1細胞在脂多糖(LPS)處理下顯示EFhd2的上調，而使用siRNA敲減THP-1中EFhd2的表達則會降低LPS處理后上清液中IL-6和TNF-α的濃度，表明EFhd2的敲除會損害LPS 誘導的免疫反應[10]。在膿毒癥小鼠中，我們研究發現，與野生小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比，EFhd2敲除小鼠來源的巨噬細胞表達更少的HLA-DR，吞噬作用和細菌殺傷能力也受損；并且EFhd2敲除小鼠在LPS或盲腸結扎穿孔術(CLP)誘導的膿毒癥中表現出更高的死亡率，嚴重的器官功能障礙，表明EFhd2參與巨噬細胞免疫應答調控[11]。

當局部損傷或炎癥發生時，源自炎癥病灶的促炎信號(如促炎細胞因子和微生物)通過誘導單核細胞從骨髓中遷移，循環單核細胞通過滾動、黏附和細胞骨架驅動的局部內皮細胞遷移而靶向炎癥位點，參與多種器官和組織的修復[12]。在人骨髓間充質干細胞(BMSCs)到成骨細胞的分化過程中，和使用NF-κB受體激活蛋白配體(RANK-L)刺激小鼠巨噬細胞系RAW264細胞分化為破骨細胞的過程中，EFhd2 mRNA的表達量均表現明顯增高[13]，表明EFhd2可能與炎癥疾病中BMSCs的自噬相關，參與骨代謝的調控。另一方面，在主動脈斑塊中的巨噬細胞中EFhd2也呈現高表達，并伴隨泡沫化程度的加重而表達增加。EFhd2敲除后巨噬細胞中泡沫化程度明顯減弱，促凋亡相關蛋白Bax、caspase-3、caspase-9以及炎癥因子IL-1β、TNF-α水平減少，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達增加，表明巨噬細胞表達的EFhd2加速動脈粥樣硬化的進展[14]。

2.1.4在B細胞中的作用 B細胞最初來源于骨髓的多能干細胞，成熟B細胞經外周血進入脾臟、淋巴結，在抗原刺激后分化增殖為質細胞，繼而合成和分泌抗體，參與體液免疫的執行。先前存在的大量研究已證明，EFhd2從祖B細胞到漿母細胞階段均有表達，并在骨髓未成熟的B細胞中表達最高，但也表達于靜息和激活的脾臟B細胞及其他非淋巴組織[2]。

B細胞受體(BCR)與其他因素一起控制著抗原誘導的繼發淋巴器官中B淋巴細胞的陽性選擇和穩態。值得注意的是，EFhd2在小鼠WEHI231細胞中可作為響應BCR刺激的脾酪氨酸激酶(Syk)活性的正性調節劑[3]，并且EFhd2可作為與B細胞脂筏相關的小銜接蛋白參與鈣信號的傳導，控制B細胞受體信號轉導。過表達EFhd2的WEHI231細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2(BH)同源蛋白Bcl-XL大約減少了3倍。相反地，EFhd2沉默細胞中Bcl-XL蛋白與對照組相比平均增加了3倍。這些結果表明EFhd2可通過與Bcl-XL的相互調節控制WEHI231細胞群的凈細胞生長和細胞的自發凋亡[2]。

在C57BL/6小鼠中敲除EFhd2并未影響B細胞對胸腺非依賴性抗原，如Nitrophenol-Ficoll和Trinitrophenol-LPS的免疫應答。與野生小鼠相比，EFhd2敲除增加了感染巴西線蟲小鼠Th2細胞介導的IgE和IgM的產生。使用綿羊紅細胞(SRBC)和蠕蟲免疫小鼠7 d后，EFhd2敲除小鼠生發中心B細胞和其它同型抗體明顯增加，表明EFhd2在生發中心依賴性的體液免疫中可作為負性調節因子[15]。

2.2 EFhd2參與調節細胞遷移細胞骨架是一種由蛋白亞基組成的纖維網狀結構，對于細胞中亞細胞器的空間排布、細胞遷移、細胞分裂及細胞凋亡起著重要作用并最終決定整體細胞形狀[16]。細胞遷移的過程可分為前緣板狀偽足的形成，新黏附的建立，肌動蛋白、肌球蛋白收縮與基質分離完成。而這些過程均依賴于肌動蛋白骨架的聚合、解聚及重新組裝，并受Rho蛋白調節。Rho家族蛋白是細胞骨架重組的主要調節因子之一，在細胞的遷移中起著重要作用。例如Cdc42是細胞極性調節和絲狀偽足形成所必需的；Rac1是板狀偽足、膜褶皺的形成和細胞遷移所必需的；而RhoA是細胞內信號轉導通路的關鍵分子，參與遷移細胞后緣的縮回。

在富含肌動蛋白細胞骨架的區域如HMC-1細胞的突起和293T細胞的膜頂端脊中EFhd2高度集聚，并呈現出肌動蛋白結合活性[6,9]。例如，在胚胎成肌細胞融合過程中，果蠅EFhd2經常與F-肌動蛋白灶重疊[17]；在PKC激動劑佛波酯和表皮生長因子(EGF)刺激下，EFhd2伴隨F-actin在COS-7和B16F10細胞中重新定位[9,18]；此外，在具有肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白(如α-輔肌動蛋白、塑性蛋白和細絲蛋白)的NK樣細胞、肥大細胞和黑素瘤細胞的細胞骨架部分中均發現了EFhd2，提示其可通過肌動蛋白重塑調節細胞活化[5,9,19]。

我們先前的研究發現，EFhd2可通過直接促進肌動蛋白聚合參與LPS刺激的巨噬細胞遷移[19]；過表達EFhd2可增強板狀偽足的形成及LPS刺激的巨噬細胞遷移，而敲除EFhd2抑制了LPS誘導的Rac1/Cdc42和磷酸化Rac1/Cdc42的表達變化[19]。雖然，EFhd2不促進由肌動蛋白相關蛋白Arp2/3復合體和WASP蛋白的VCA結構域介導的肌動蛋白聚合，但EFhd2在絲氨酸殘基183(Ser183)位點的磷酸化可通過抑制肌動蛋白絲的聚集和調節F-肌動蛋白對cofilin的可及性參與肌動蛋白的解聚[18]。類似的，Huh等[4]發現EFhd2異位表達增強了與肌動蛋白相關的突起如板狀偽足和膜褶皺的形成，并激活B16F10細胞中的Rac1和Cdc42活性。

EFhd2位于70～199個氨基酸之間含有3個肌動蛋白結合位點(69～96，96～163和163～199)[19]。在EFhd2的N端區域(氨基酸1～69)和C端卷曲螺旋區域(氨基酸200～240)中鑒定出非常弱或沒有肌動蛋白結合位點，然而這些位點對于由EFhd2調節的肌動蛋白親和力是必不可少的[17,19]。與對照相比，敲除EFhd2的EF手基序(D97～163，M2)后顯示出較少的肌動蛋白成束活性，而卷曲螺旋結構域(1～163，M1)的敲除消除了肌動蛋白成束活性，顯示細胞質區域細胞鋪展和板狀偽足形成明顯減少，表明EFhd2的卷曲螺旋結構中富含賴氨酸的區域(218～240)對于肌動蛋白成束活性是必不可缺的[6]。

3 EFhd2調節免疫炎癥反應的信號通路

已知EFhd2可參與多種信號通路的調節。如HMC-1肥大細胞的PKC-βI/η[8]、Jurkat T細胞的NF-κB和PKC-θ[6]、WEHI231 B細胞的BCR[2]、破骨細胞樣細胞的核因子κB受體活化因子配體(RANKL)[10]、巨噬細胞中的JAK2/STAT1/3[11]、腎小球內皮細胞中的PKC-β[20]和腎小球足細胞的MAPK信號通路[21]、Ca2+信號的轉導[17]等。其中NF-κB、JAK-STAT和MAPK作為最主要的三條炎癥信號通路，EFhd2均被報道參與其中。

3.1 參與NF-κB信號通路轉導NF-κB是一種重要的免疫炎癥信號通路，參與調控促炎介質如細胞因子、趨化因子和粘附因子等基因的表達。值得注意的是，EFhd2在NF-κB活化中具有雙重作用。在BCR信號通路中作為NF-κB活化的負調節劑[2]，而在PKC信號通路中作為NF-κB的正調節劑[8]。

Kim等[6]發現在佛波酯PMA/A23187刺激后，Jurkat T細胞中異位表達的EFhd2顯著增強了NF-κB的轉錄活性和IκB-α降解，以及促炎細胞因子的表達；而在特異性NF-κB活化抑制劑咖啡酸苯乙酯(CAPE)的刺激下，阻斷了EFhd2表達上調。此外，Nomiyama等[10]通過NF-κB配體的受體激活劑RANKL和TNF-α以及巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)三者聯用處理小鼠巨噬細胞RAW264.7后也發現，EFhd2基因的表達上調，表明NF-κB信號傳導對于巨噬細胞中EFhd2的誘導至關重要。

相反，Avramidou等[2]通過BCR刺激未成熟小鼠B淋巴細胞WEHI231，發現沉默EFhd2誘導了強烈的IκB-α磷酸化和降解，但在對照細胞和異位表達EFhd2的細胞中并沒有觀察到此現象，表明EFhd2在經典NF-κB信號通路的活化中可能起負性調節作用。

3.2 參與JAK-STAT和MAPK信號通路轉導JAK-STAT信號通路作為多種細胞因子和生長因子在細胞內傳遞信號的共同途徑，參與炎癥和類風濕關節炎、銀屑病和炎癥性腸病等多種自身免疫疾病。IFN-γ與其細胞表面受體IFN-γR結合后可激活下游的JAK-STAT信號通路，繼而激活某些抗炎基因的表達，參與啟動和調控免疫炎癥[22]。

前期研究中，我們發現EFhd2敲除抑制了由IFN-γ激活的STAT1和STAT3磷酸化[11]。與LPS處理后的野生型相比，EFhd2-/-膿毒癥小鼠血清與T細胞中IFNγ水平減少，巨噬細胞中IFN-γR的表達水平和JAK-STAT通路的活化(JAK2，STAT1和STAT3磷酸化)也均明顯降低；相反，過表達EFhd2明顯增加了JAK2/STAT1/3的磷酸化[11]。另一方面，曹雪濤等[22]發現EFhd2與布魯頓酪氨酸蛋白激酶(BTK)磷酸化的Ⅰ型IFN受體的β亞基(IFN-γR2Y289)相互作用，促進IFN-γR2的膜轉運，并形成功能性IFN-γR以介導IFN-γ信號轉導，從而參與啟動巨噬細胞對于胞內細菌感染的有效先天性免疫反應。并且，李斯特菌感染的EFhd2敲除鼠與同窩野生型小鼠相比，在腹腔巨噬細胞的細胞膜上顯示出IFN-γR2表達顯著降低，并且其TNF-α和IL-6 mRNA也遠低于野生型[22]。以上結果表明，EFhd2不僅影響IFN-γR1的表達，而且對于驅動IFN-γR2膜轉運也是不可或缺的。

另一方面，MAPK信號通路在細胞的增殖、分化和凋亡中也起著非常重要的作用。我們前期研究發現，腎小球足細胞MPC-5表達EFhd2，使用鏈脲佐菌素和高葡萄糖處理后EFhd2表達增加；雖然敲除EFhd2與野生型對照組之間p38的磷酸化水平并沒有明顯差異，但p38的磷酸化水平在野生型糖尿病小鼠中卻是增加的；EFhd2敲除糖尿病小鼠和高糖處理的EFhd2敲減的MPC-5細胞中p38的磷酸化水平及足細胞凋亡均受到抑制；給予p38抑制劑SB203580減少了高糖誘導的細胞凋亡。這些結果表明EFhd2在糖尿病腎病早期可通過激活p38 MAPK信號通路促進足細胞凋亡[21]。

3.3 參與Ca2+信號轉導Ca2+是絕大部分細胞必不可缺的第二信使，持續的Ca2+流入對于淋巴細胞的激活和適應性免疫反應均起著至關重要的作用。Ca2+信號轉導通常通過EF手型(EF-hand)家族的Ca2+結合蛋白參與執行，如通過鈣調神經磷酸酶激活NFAT的鈣調蛋白[17]。

EFhd2作為一種Ca2+銜接蛋白，可將Syk，SLP-65和PLCγ2結合在一起介導BCR誘導的鈣離子流動[1-2,9]。在小鼠B細胞系WEHI213細胞中，過表達EFhd2明顯增強了IgM抗體刺激后BCR誘導的游離鈣離子濃度，而敲除EFhd2顯示低鈣離子濃度[2,23]。并且與野生型EFhd2相比，富含脯氨酸的區域(PR)、N-端無序區域(LC)和EF1缺失的突變體并未恢復BCR誘導的鈣離子流動，表明EFhd2的PR、LC和EF1區域對于BCR誘導的鈣離子流動是必不可缺的[2]。Kroczek等[3]發現，EFhd2蛋白可通過負性調節NF-κB抗細胞凋亡途徑影響細胞存活和內質網儲存的鈣流出。然而，Morowski等[24]使用經典血小板激動劑如膠原相關肽(4 mg·L-1)和凝血酶(10-5U·L-1)刺激血小板15 min后，發現EFhd2敲除小鼠的血小板并未改變正常的Ca2+儲存和釋放，表明EFhd2對于血小板中的Ca2+信號傳導是非必需的。

通過構建EFhd2蛋白N-末端聚丙氨酸區域、高度保守的C-末端卷曲螺旋區域和EF-手基序截短突變體并進行鈣結合活性測定，Ferrer-Acosta等[25]發現，EFhd2的鈣結合活性取決于兩個EF-手基序的完整性，N-末端和C-末端敲除增強了EFhd2的鈣結合能力。保守的谷氨酸殘基即E116和E152分別位于EFhd2的EF1和EF2的-Z位置。Hagen等[23]發現，E116、E152單個突變使得鈣結合能力減半，而雙突變則鈣結合力消失，進一步表明了EF1和EF2的保守殘基E116A和E152A是EFhd2鈣結合必不可少的。

4 結語

目前研究發現，EFhd2與急性-被動皮膚過敏和慢性特異性皮炎、膿毒癥、類風濕關節炎、糖尿病腎病等自身免疫疾病相關，并通過NF-κB、JAK-STAT、MAPK和Ca2+等多種信號通路參與炎癥細胞因子的激活，敲除EFhd2可抑制炎癥的發生，但也有部分報道認為EFhd2可作為免疫炎癥的負性調節因子。總之，EFhd2在免疫和炎癥性疾病中的作用仍需要進一步的研究，為免疫炎癥反應的防治提供新的思路。