基于尿液代謝組學研究豆豉抗骨質疏松作用機制

盛玲玲，李先娜，霍金海，湯慶發，燕 月，王偉明

(1.南方醫科大學中醫藥學院，廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東省中藥制劑技術工程實驗室，廣東，廣州 510515; 2. 黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江，哈爾濱 150036)

絕經后骨質疏松癥(post menopausal osteoporosis，PMOP)是由于絕經后婦女雌激素水平顯著降低，導致骨形成和骨吸收的動態平衡破裂，引起女性骨鈣流失嚴重，造成骨質疏松癥[1]。研究表明[2]，豆豉含有豐富的有效成分，包括大豆異黃酮、維生素K2、納豆激酶、鈣等微量元素。其中，大豆異黃酮是具有生理功能的植物雌激素，如預防骨質疏松、抗氧化和調節血脂等。本研究通過去除大鼠卵巢構建PMOP動物模型，并基于代謝組學技術探究豆豉對PMOP的干預作用和機制，為豆豉治療POMP的藥效學研究及POMP新藥研發提供科學的實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物由哈爾濱醫科大學實驗動物科學系提供的32只SPF級健康SD ♀大鼠，體質量(180～200) g。動物合格證書號為SCXK(黑)2013-001。

1.2 藥品與試劑拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，戊酸雌二醇片(補佳樂)藥品，國藥準字J20130009，批號255B；哈藥集團制藥總廠，青霉素鈉藥，國藥準字H23021441，批號17121212-1；廣州屈臣氏食品飲料有限公司，蒸餾水；山東利爾康醫療科技有限公司，碘伏消毒液試劑；天津市光復精細化工研究所，水合氯醛試劑；實驗用哈爾濱三聯藥業股份有限公司，0.9%氯化鈉注射液試劑；南京建成生物工程研究所，血清骨鈣素(OC，批號：20180810)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP，批號：20180820)試劑盒；堿性磷酸酶(ALP，批號：HC02T01)、無機磷(P，批號：HC23S01)、鈣(Ca，批號：HC10S01)試劑盒，上海華臣生物試劑有限公司；肌酐檢測試劑盒(酶法,批號：058250)，協和梅迪克斯醫療器械(上海)有限公司。

1.3 儀器與設備中國Holigic公司，ASY-00409型雙能X線骨密度儀；青島海爾特種電器有限公司，DW-86L959型超低溫冰箱；Medel 450型酶標儀，瑞典Bio-Rod公司提供；IKA?MS3 digital型渦旋振蕩器，廣州儀科實驗室技術有限公司；上海賽默生物科技發展有限公司，Biofuge?Stratos型全能臺式高速低溫離心機；美國RAININ公司，E4XLS型移液器；日本日立公司，7060全自動生化分析儀。

1.4 豆豉制備方法將大豆煮熟后，經106～108CFU·ML-1枯草芽孢桿菌發酵而成，由黑龍江省中醫藥科學院提供，批號：20180501。

1.5 動物分組及給藥參考文獻[3]，適應性喂養1周后，32只SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組、雌二醇組及豆豉組，每組8只。各組大鼠腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)并固定仰臥位。75%酒精消毒，沿下腹正中線切口2～3 cm。除假手術組，首先暴露“Y”型子宮角，結扎子宮角，取出雙側卵巢，只切除假手術組卵巢周圍少許脂肪組織。閉合切口并逐層縫合，腹腔內注射青霉素鈉(4萬U/只)5 d。術后所有大鼠在室溫(22.5～24.0) ℃及濕度的53.0%～54.5%的SPF級飼育室飼養。

發酵后的豆豉經真空冷凍干燥后，獲得豆豉超微凍干粉，出粉率為41%。術后飼養1周后開始給藥，根據豆豉成年人日服用量為30 g·d-1，戊酸雌二醇(補佳樂)成人日用量為1 mg·d-1，按照實驗動物學中的體表面積的換算方法，故豆豉給藥組大鼠給藥劑量每天為2.7 g·kg-1，雌二醇組大鼠每天為0.09 mg·kg-1，大鼠每日灌胃量為10 mL·kg-1。將適量0.5% CMC-Na水溶液加入到超微凍干的豆豉粉末中，超聲30 min，配制成含豆豉凍干粉110 g·L-1及雌二醇0.009 g·L-1灌胃液，模型組和假手術組大鼠灌胃相同體積0.5% CMC-Na水溶液8周。

1.6 生物樣本采集與處理在最后一次灌胃后，大鼠禁食12 h，自由飲水。將大鼠置于代謝籠內收集12 h的尿液，4 ℃，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液并置-80 ℃冰箱備用。通過頸椎脫臼法處死大鼠，將左側股骨分離出來，剝離組織，用0.9%生理鹽水濕潤紗布并包裹離體股骨，置-80 ℃冰箱備用，用于骨密度測定。另取大鼠子宮并精確稱重以計算子宮指數。

1.7 觀察指標及檢測方法(1)體質量：記錄在實驗第0天、第2周、第4周、第6周、第8周大鼠體質量，繪制大鼠體質量生長曲線。(2)子宮指數：取出子宮后立即稱定大鼠子宮濕重，并根據公式計算子宮指數(子宮濕重/大鼠體質量)。(3)骨密度(BMD)：取出冷凍的股骨，在4 ℃的冰箱中解凍，將股骨放置薄壁有機玻璃盒內，裝入去離子水約4.0 cm，在Hologic雙能X線骨密度儀平臺上放置股骨,并沿平臺長軸放置，對大鼠股骨進行掃描，采用Hi-Res(高分辨)，Small animal模式掃描，并測量股骨密度。

1.9 尿液代謝組學研究

1.9.1尿液樣本的處理 取出凍存尿液，于4 ℃冰箱中解凍，從所有組別大鼠尿液樣本中各取50 μL，渦旋60 s，標記為尿液QC樣本，每組另取1 mL尿樣，并通過0.22 μm微孔濾膜，取濾液5 μL供UPLC-Q/TOF-MS分析。

1.9.2分析條件

色譜檢測條件 色譜柱：ACQUITY UPLC C18柱；色譜分離條件為:柱溫為30 ℃；流速0.2 mL·min-1；流動相組成A:0.1%甲酸-水，B:0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0～2 min，5%～10%B；2～9 min，10%～30%B；9～16 min，30%～100%B；16～18 min，100%B；18～18.1 min，100%～5%B；18.1～20 min，5%B。

質譜條件 在正、負離子模式下采用電噴霧離子源采集數據。正離子模式：離子源電壓(ISVF)為5 500 V，溫度(TEM)為550 ℃，裂解電壓(DP)為100 V，碰撞能量(CE)為40 eV，碰撞能量擴展(CES)為20 eV。氮氣為霧化氣體，輔助氣Gas1(55 psi)，輔助氣Gas2(55 psi)，氣簾氣(CUR)為35 psi。負離子模式：離子源電壓(ISVF)為-4 500 V，碰撞能量(CE)為-40 eV，碰撞能量擴展(CES)為-20 eV，裂解電壓(DP)為-100 V；其他參數同于正離子模式。扣除動態背景(DBS)，一級質譜Ion Scan Range為m/z 100～1 000 Du，IDA值超過100 cps的8個最高峰進行二級質譜掃描，Ion Scan Range為m/z 100～1 000 Du。數據采集軟件為Analyst TF 1.6 software工作站；采用CDS質量校正系統在線校正。

1.9.3代謝組學數據處理 本實驗以生物標志物及其變化規律為切入點，應用代謝組學方法，充分采用UPLC-Q-TOF/MS手段，通過現代信息科學和生物統計學方法對獲得的多維復雜數據進行降維和信息挖掘。對尿液樣品進行檢測，將UPLC-Q-TOF/MS分析所得數據導入Progenisis QI軟件，對原始采集數據進行校正，包括色譜峰提取、峰匹配、峰對齊、峰識別以及數據歸一化等，主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析法(OPLS-DA)用于降低所獲得的多維復雜數據的維度，繪制出反映組間離散程度的得分圖(score plots),最后根據鑒定結果聯合人類代謝組數據庫(HMDB)、KEGG等數據庫及大量文獻對生物標志物進行生物學意義的解釋，實現對數據統計分析。

2 結果

2.1 豆豉對去卵巢骨質疏松大鼠體質量的影響每組大鼠生存狀態良好、正常飲食、二便正常，體質量模型組增加。模型組大鼠在給藥第4周，6周，8周顯示出明顯的體質量增加，且明顯高于假手術組(P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，雌二醇組和豆豉給藥組大鼠體質量下降。

2.2 豆豉對去卵巢骨質疏松大鼠骨密度和子宮指數的影響如Tab 2,給藥8周后，與假手術組相比，模型組大鼠股骨BMD及子宮指數下降(P<0.01)。與模型組相比，戊酸雌二醇組BMD和子宮指數增加，BMD與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)；豆豉組大鼠BMD和子宮指數高于模型組(P<0.01)。

2.3 尿液代謝組學研究

2.3.1尿液代謝譜分析 采用UPLC-Q-TOF-MS法進行尿液樣本的分離與數據采集，假手術組、模型組、雌二醇組及豆豉組具有代表行的總離子流圖(Fig 1)。對比發現，模型組大鼠尿液代謝譜圖與假手術組相比存在明顯差異，結果表明取出卵巢后雌性大鼠體內代謝輪廓及相關代謝物存在明顯變化。

Tab 1 Effect of soybean meal on body weight of ovariectomized osteoporosis

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig 1 Based peak chromatogram obtained from positive ion and negative ion

A,E: Control group; B, F: Model group; C, G: Estradiol group; D, H: Soybean meal group

GroupBMD(g·cm-2)Uterine indexControl0.25±0.021.76±0.31Model0.18±0.03**0.33±0.09**Estradiol0.24±0.01#0.81±0.23Soybean meal0.25±0.01##0.70±0.26##

*P<0.05,**P<0.01vsControl;#P<0.05,##P<0.01vsModel

2.3.2大鼠體內代謝輪廓經時變化分析 運用EZinfo2.0軟件對模型組大鼠尿液代謝輪廓的經時軌跡變化進行分析，結果顯示給藥第8周的尿液代謝輪廓與給藥d 0相聚較遠，提示大鼠去卵巢后，隨著時間延長體內代謝輪廓發生明顯擾動且逐漸遠離初始代謝輪廓區域，進而導致骨質疏松癥的發生與發展。此外，對給藥第 8周模型組、假手術組、雌二醇組和豆豉組大鼠代謝輪廓進行PCA分析，結果顯示模型組與假手術大鼠代謝輪廓區分明顯，豆豉和雌二醇組大鼠代謝輪廓遠離模型組而趨向于假手術組，結果提示豆豉可顯著回調模型大鼠體內異常代謝輪廓，進而干預了絕經后骨質疏松癥的發生與發展(Fig 3)。

2.3.3潛在生物標志物的篩選 為了進一步明確區分各組差異，對假手術組、模型組大鼠尿液代謝物進行無監督的OPLS-DA。結果顯示出模型組與假手術組具有很好的區分。結合S-plot和VIP-plot分析結果，篩選VIP>1且P<0.05差異性代謝物。最終篩選得到23個差異生物標志物(Tab 3)。

以17-羥基孕烯醇酮(17-Hydroxypregnenolone)為例簡述二級解析過程。

以通過對比潛在生物標記物在模型組與假手術組中的峰面積，其中去卵巢后模型組大鼠體內5個標記物表達水平明顯上升，18個標記物表達水平顯著下降。

2.3.4代謝通路分析 基于MetPA平臺，進一步將23個絕經后骨質疏松癥潛在代謝標記物進行代謝通路拓撲分析，結果顯示，23個尿液代謝標記物主要參與9個代謝途徑， 包括類固醇激素生物合成、抗壞血酸與醛酸代謝、乙醛酸和二羧酸鹽代謝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、初級膽汁酸生物合成、嘌呤代謝、淀粉與蔗糖代謝、肌醇磷酸代謝、三羧酸循環(Tab 4)。

Fig 2 PCA score plot of model rats metabolicfootprint

A:Positive model; B:Negative model

Fig 3 3D-PCA score plot of each group rats on 8th week

Fig 4 Pattern recognition analysis in different ion modes of urine samples in control group and model group

A:OPLS-DA score plotin positive ion mode;B:OPLS-DA score plot in negative ion mode;C:S-Plot of OPLS-DA analysis in positive ion mode;D:S-plot of OPLS-DA analysis in negative ion mode;E:VIP-Plot of OPLS-DA analysis in positive ion mode;F:VIP-Plot of OPLS-DA analysis in negative ion mode

Fig 5 Mass fragmentation pathway of17-hydroxypregnenolone based on UPLC-Q-TOF-MS

2.3.5豆豉對去卵巢骨質疏松癥大鼠尿液生物標志物的調節作用 基于本研究篩選出去卵巢骨質疏松癥大鼠尿液生物標志物，運用MetPA平臺，對給予豆豉模型生物標記物變化進行Heatmap分析，結果發現，豆豉給藥組尿液生物標記物含量發生明顯變化(Fig 6)。統計學分析結果表明，豆豉可顯著回調12個潛在生物標志物。

Tab 3 Potential biomarkers of sham-operated and model groups

Tab 4 Metabolic pathway of POMP urine biomarkers with MetPA analysis

基于MetPA平臺分析發現豆豉主要通過調節類固醇激素生物合成、抗壞血酸與醛酸代謝、戊糖和葡糖醛酸鹽轉化、淀粉與蔗糖代謝和肌醇磷酸代謝5個代謝通路起到預防絕經后骨質疏松癥作用。

3 討論

3.1 豆豉對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝相關因子的影響去勢方法是目前構建PMOP動物模型最常用方法[4-6]。雌激素水平驟然降低，對成骨細胞的刺激減弱，骨吸收大于骨形成，導致骨質疏松癥，因此去勢大鼠被美國FDA規定為研究骨質疏松癥的首選動物模型[7]。3月齡♀大鼠更成熟，激素代謝水平變得穩定。本實驗中，將3月齡雌性大鼠切除雙側卵巢，8周后測量骨密度，結果顯示，模型組大鼠左側股骨骨密度低于假手術組，骨量減少表明成功構建骨質疏松癥動物模型。

Fig 6 Heatmap visualization based on metabolites of control group and model group

Fig 7 Metabolic pathway of PMOP urine biomarkers with MetPA analysis

豆豉是由大豆煮熟后經芽孢桿菌發酵而成，富有營養價值。研究證明，豆豉具有預防疾病和保健功能，如預防骨質疏松癥、溶解血栓、抗癌、降血壓等[8]。實驗證實，給予豆豉后卵巢切除動物的骨密度和骨強度可明顯增加[9]，人食用豆豉后，骨密度顯著增加，骨質疏松性骨折的風險顯著降低[10]。本實驗通過對去勢雌性大鼠灌胃豆豉，飼養8周后，豆豉組、戊酸雌二醇組大鼠骨密度、子宮指數比模型組均增加。與模型組相比，豆豉可抑制去勢大鼠骨量丟失，導致大鼠骨質密度增加，子宮指數提高。

3.2 尿液代謝組學潛在生物標志物的生物學意義黃體酮是一種類似孕酮的孕激素。研究表明，黃體酮可通過不同方式調節骨代謝：①恢復骨重建至正常水平；②增加降鈣素的釋放，調節PTH活性；③增加腸鈣吸收；④降低破骨活性抑制破骨細胞因子；⑤刺激有局部作用的生長因子誘導成骨細胞增長[11]。研究表明，模型組大鼠尿液中黃體酮水平降低，提示大鼠去卵巢后可引起黃體酮水平降低，影響骨重建、降鈣素釋放和腸鈣的吸收，使骨吸收超過骨形成，導致PMOP。豆豉組與模型組相比黃體酮水平升高，提示豆豉在降低骨重建、提高降鈣素的釋放和增加腸鈣吸收方面發揮了作用。

Fig 8 Heatmap visualization based on urine metabolites ineach group

脫氫表雄酮(DHEA)是一種類固醇激素，通過腎上腺皮質網狀帶中的芳香化酶催化膽固醇合成的。DHEA在酶的作用下最終轉化為雄烯二酮、雌酮、雌二醇( E2) 等，因此DHEA可有效平衡體內激素水平，進而防治PMOP[12]。本研究表明，模型組大鼠尿液中DHEA水平降低，提示大鼠去卵巢后可引起DHEA水平降低，進而引起雌激素含量下降，導致PMOP。豆豉組與模型組相比DHEA水平升高，提示豆豉在提高體內雌激素水平含量方面發揮了作用。

11-脫氧皮質酮是由腎上腺產生的類固醇激素，具有鹽皮質激素活性，最終可轉化為醛固酮。實驗證實，黃體酮可以在酶的作用合成脫氧皮質酮，然后轉化為皮質酮，最后通過醛固酮合酶轉化為醛固酮[13]。成骨細胞和破骨細胞中鑒定出的礦物質類皮質激素受體(MRs)，表明醛固酮對骨轉換有影響。研究表明，醛固酮信號通路NR3C2和PIK3R1參與骨代謝的調節，其中，NR3C2編碼鹽皮質激素受體，醛固酮通過與成骨細胞和破骨細胞上的鹽皮質激素受體結合促進成骨細胞分化，而PIK3R1調節成骨細胞和破骨細胞分化的磷脂酰肌醇激酶3的亞基參與骨代謝的調節[14]。本研究結果顯示，模型組大鼠尿液中醛固酮水平降低，提示大鼠去卵巢后可引起醛固酮水平降低，調節醛固酮信號通路NR3C2和PIK3R1，進而導致PMOP。豆豉組與模型組相比醛固酮水平升高，說明豆豉可通過調節NR3C2和PIK3R1醛固酮信號通路，使骨代謝回調到正常水平，進而防治PMOP。

Fig 9 Regulatory effect of soybean meal on PMOP metabolite biomarkers

綜上所述，本研究發現豆豉可明顯逆轉12個標記物異常表達，例如11-脫氧皮質酮、黃體酮、2-甲氧基雌二醇、21-羥基孕烯醇酮、21-脫氧皮質醇和脫氧皮質酮等，其主要通過調節類固醇激素生物合成、抗壞血酸與醛酸代謝、戊糖和葡糖醛酸鹽轉化、淀粉與蔗糖代謝和肌醇磷酸代謝起到預防骨質疏松癥作用。結果表明豆豉對雌激素水平下降誘導的骨質疏松癥有良好的防治作用，本研究首次闡明了豆豉防治PMOP作用機制，為進一步發現臨床有效且毒副作用小的抗PMOP藥物提供一定的科學依據。

(致謝：在黑龍江省中醫藥科學院中藥所分析室及動物室實驗過程中，本人衷心地感謝給予我老師及全體同學！)