維生素D對過氧化氫誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

胡 聰，吳 顓，李亞林，朱高路，曹朝暉，胡小波

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,湖南 衡陽 421001)

在過去的幾十年中，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為全球公共醫(yī)療問題的主要關(guān)注點(diǎn)之一[1]。DM是一種慢性、常見的非傳染性疾病，是以血糖水平升高為特征的葡萄糖代謝紊亂性疾病。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會報告，2011年估計有3.66億個病例，到2030年預(yù)計將增長到5.52億個病例[2]。此外，5%的死亡病例由DM引起，并且這一數(shù)據(jù)正在迅速增長。1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種自身免疫性疾病，其特征是體內(nèi)免疫細(xì)胞攻擊胰島中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡。引起胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要原因包括①炎癥刺激：巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生可溶性的中介因子殺傷β細(xì)胞[3]；②氧化應(yīng)激：高糖、高脂環(huán)境、間歇性低氧、活性氧簇表達(dá)增加等可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]；③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可引起胰島β細(xì)胞凋亡。

維生素D(vitamin D，VitD)是一種重要的生理調(diào)節(jié)劑，其受體存在于多種組織細(xì)胞中，包括腸、骨、腎、造血組織以及胰腺β細(xì)胞。VitD是由膽固醇前體(7-脫氫膽固醇)合成的脂溶性類固醇，其具有化學(xué)類固醇結(jié)構(gòu)[5]。人體中主要形式的VitD是VitD2或麥角鈣化醇，由植物中的麥角甾醇合成，而VitD3或膽鈣化醇是由動物膽固醇合成[5]。VitD的活性形式是1,25(OH)2VitD3，通過不同的機(jī)制在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。它不僅可以改善靶細(xì)胞(如骨骼肌、肝臟和脂肪組織)的胰島素敏感性，還可以直接通過對β細(xì)胞的作用和間接地通過作用于不同的免疫細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞)來保護(hù)β細(xì)胞免受有害的免疫攻擊。此外，VitD還可直接通過核內(nèi)維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)刺激胰島素分泌[6]。大量研究提示，VitD是T1DM、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和妊娠期糖尿病的重要影響因素，1,25(OH)2VitD3通過與體內(nèi)VDR結(jié)合，參與調(diào)節(jié)免疫功能，并在胰島素的合成、分泌中發(fā)揮了重要作用[7]，但其作用機(jī)制及在DM防治中的地位尚存許多爭議，本實(shí)驗(yàn)主要探討VitD是否能減少由過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，預(yù)防DM的發(fā)生，為T1DM的防治提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司(貨號：SH30022.01) ；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gemini公司(貨號：900-108)；胰酶細(xì)胞消化液(產(chǎn)品編號：C0201)、青霉素-鏈霉素溶液(100×)(產(chǎn)品編號：C0222)、Bax(貨號：AB026)、Caspase-3(貨號：AF0081)購自碧云天公司；維生素D(貨號：D1530-10UG)、過氧化氫溶液(貨號：323381)、Hoechst 33258溶液(貨號：94403-1ML)購自Sigma公司；CCK-8試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本同仁公司(貨號：CK04)；Annexin V-FITC/PI apoptosis assay kit購自NeoBioscience公司(貨號：FAK011)；高效裂解液(RIPA)購自Thermo Fisher Scientific公司(批號：TK274910)；PMSF購自Solarbio公司(貨號：P0100)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：CW0014S)、SDS-PAGE凝膠購自康為世紀(jì)公司(貨號：CW0022S)；PVDF膜(貨號：BS-PVDF-45；BS-PVDF-22)、ECL發(fā)光液購自millipore公司(貨號：WBLUR0100)；一抗Bcl-2(貨號：3498T)、Cleaved caspase-3(貨號：9661T)購自CST公司，β-actin購自O(shè)rigeng公司(貨號：TA811000)；山羊抗鼠二抗購自SAB公司(貨號：L3032-1)，山羊抗兔二抗購自absin公司(貨號：abs20002ss)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺購自蘇州安泰公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司；CO2培養(yǎng)箱購自Thermo(America)公司；高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf(German)公司；Cytation3購自Bio-Tek (USA)公司；細(xì)胞流式檢測儀購自BD FACSCalibur公司；雙垂直蛋白電泳購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀購自Tanon-6200公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫。MIN6細(xì)胞在含有15%胎牛血清、1% 100 mg·L-1鏈霉素、1% 100 U·mL-1青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，5% CO2、37℃、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)[3,7]。細(xì)胞貼壁生長至密度達(dá)到80%左右，按1 ∶3的比例傳代。以1×104/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2×105/孔接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)MIN6細(xì)胞24 h。當(dāng)MIN6細(xì)胞貼壁生長12 h后，采用VitD預(yù)處理后，用H2O2處理細(xì)胞不同時間。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力接種于96孔板中的MIN6細(xì)胞用不同濃度的H2O2處理，觀察H2O2對MIN6細(xì)胞活力的影響，VitD預(yù)處理后加H2O2處理3、6、12、24、48 h，觀察VitD對MIN6細(xì)胞活力的影響。到時間后，每孔加入10 μL CCK-8，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，用Cytation 3檢測450 nm波長處各組的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率/%=(AH2O2處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Hoechst 33258檢測細(xì)胞凋亡6孔板中的MIN6細(xì)胞分為3組：①空白對照組；②VitD(5 nmol·L-1)預(yù)處理3 h再加H2O2(100 μmol·L-1)處理24 h組；③H2O2(100 μmol·L-1)處理24 h組做細(xì)胞爬片，到時間后PBS洗滌細(xì)胞，加入0.5 mL 4%多聚甲醛室溫固定15～30 min，棄去固定液，PBS洗滌細(xì)胞，吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，室溫避光染色15 min，染色后，PBS洗滌細(xì)胞，吸盡液體，滴一滴50 μL抗熒光淬滅封片液封片，光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，熒光顯微鏡檢測各組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮情況(呈致密濃染)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)分組見1.5，藥物處理后收集細(xì)胞于流式管，PBS洗滌細(xì)胞兩次后，用結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC，避光孵育15 min左右，用結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，再加10 μL濃度為20 mg·L-1的碘化丙錠，輕輕混勻后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。Flowjo 7.6分析流式結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot按5×105個細(xì)胞/瓶將MIN6細(xì)胞均勻接種到培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后用VitD預(yù)處理3 h，然后用H2O2處理24 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，離心，裂解后提取總蛋白，采用Cytation3檢測總蛋白水平。按30～50 μg的蛋白上樣量，確定對照組及實(shí)驗(yàn)組蛋白的上樣體積，根據(jù)目的蛋白分子量大小，采用不同濃度的SDS-PAGE分離膠分離各組總蛋白，濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1～2 h。然后孵一抗，抗體按1 ∶500或1 ∶1 000進(jìn)行稀釋，室溫孵育2 h或4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次15 min，根據(jù)一抗來源，再加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗，按1 ∶5 000進(jìn)行稀釋，室溫孵育45 min～1 h，TBST洗滌3次，每次15 min，采用Tanon-6200檢測蛋白表達(dá)并分析結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 H2O2降低MIN6細(xì)胞活力在MIN6細(xì)胞中，首先檢測了不同濃度的H2O2處理24 h對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，隨著H2O2濃度的增加，MIN6細(xì)胞活力降低(Fig 1A)。當(dāng)H2O2濃度為100 μmol·L-1時，細(xì)胞活力降低至60%左右，因此，選用100 μmol·L-1H2O2的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時，還檢測了100 μmol·L-1H2O2作用不同時間對MIN6細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，隨著H2O2作用時間的延長，MIN6細(xì)胞活力降低(Fig 1B)。當(dāng)用100 μmol·L-1H2O2作用24 h時，細(xì)胞活力降低至60%左右，因此，選用100 μmol·L-1H2O2作用24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Activity of MIN6 cells inhibited by H2O2

2.2 VitD減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡檢測不同濃度VitD處理24 h對MIN6細(xì)胞活力的影響(Fig 2A)，結(jié)果表明VitD無細(xì)胞毒性。向細(xì)胞中加入不同濃度的VitD預(yù)處理24 h后用100 μmol·L-1H2O2處理MIN6細(xì)胞24 h，CCK-8法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果表明，當(dāng)VitD濃度為5 nmol·L-1時細(xì)胞活力達(dá)到80 %左右，因此選用5 nmol·L-1VitD用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(Fig 2B)。用5 nmol·L-1VitD預(yù)處理細(xì)胞不同時間，再用100 μmol·L-1H2O2處理MIN6細(xì)胞24 h，檢測細(xì)胞活力，結(jié)果表明，當(dāng)VitD預(yù)處理3h時，與H2O2組相比，結(jié)果差異有顯著性(P<0.01)(Fig 2C)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用濃度5 nmol·L-1VitD預(yù)處理細(xì)胞3 h，探討VitD對MIN6細(xì)胞的保護(hù)作用。

Fig 2 H2O2- induced apoptosis reduced by VitD

Fig 3 Effects of H2O2 treatment for 24 h after VitD pretreatment for 3 h and H2O2 treatment for 24 h on nuclear morphology of MIN6 cells(×200)

Fig 4 Effects of H2O2 treatment for 24 h after VitD pretreatment for 3 h and H2O2 treatment for 24 h on MIN6 cells(n=3)

2.3 Hoechst 33258染色觀察MIN6細(xì)胞核形態(tài)Hoechst 33258染色后，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)Control組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，單獨(dú) H2O2處理24 h組與VitD預(yù)處理3h后H2O2處理24 h組比，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮、呈致密濃染的細(xì)胞增加(如紅色箭頭所示)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)觀察MIN6細(xì)胞凋亡百分率H2O2(100 μmol·L-1)單獨(dú)處理，VitD(5 nmol·L-1)預(yù)處理3 h后H2O2處理MIN6細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞凋亡百分率。結(jié)果表明，VitD預(yù)處理3 h后H2O2處理24 h組凋亡百分率為7.78 %，H2O2單獨(dú)處理24 h組凋亡百分率為20.2 %，細(xì)胞壞死率低于8.4%，由此可知，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是由凋亡引起的，而VitD預(yù)處理3 h后，H2O2再處理能減少細(xì)胞凋亡。

2.5 H2O2單獨(dú)與用VitD預(yù)處理后對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響H2O2(100 μmol·L-1)單獨(dú)處理，與VitD(5 nmol·L-1)預(yù)處理3 h后加H2O2處理MIN6細(xì)胞24 h，觀察凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果表明，與Control組比，H2O2組Bcl-2、Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05或P<0.01,Fig 5A)，Bax(P<0.05，F(xiàn)ig 5A)、Cleaved caspase-3(P<0.05或P<0.01,Fig 5B)、Cleaved caspase-3/caspase-3比值增加(P<0.01，F(xiàn)ig 5B)，Caspase-3表達(dá)差異無顯著性(Fig 5B)。與H2O2組比，VitD+H2O2組Bcl-2、Bcl-2/Bax比值上調(diào)(P<0.05或P<0.01,Fig 5A)，Bax(P<0.01，F(xiàn)ig 5A)、Cleaved caspase-3(P<0.01，F(xiàn)ig 5B)、Cleaved caspase-3/caspase-3(P<0.01，F(xiàn)ig 5B)比值下調(diào)。由圖可知，VitD能減少由H2O2誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax和Cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)。

3 討論

自身免疫性T1DM和代謝紊亂性T2DM長期以來被認(rèn)為在疾病流行、發(fā)病、體重、胰島炎的存在和自身抗體方面顯示出明顯的差異。然而，最新數(shù)據(jù)表明，T1DM和T2DM可能在疾病發(fā)病機(jī)制中表現(xiàn)出更多的相似之處[9]。現(xiàn)在越來越明顯的是，T2DM患者也出現(xiàn)炎癥，早期疾病發(fā)作和胰島自身免疫[10]。相比之下，T1DM患者更常見于兒童肥胖，并且曾經(jīng)被稱為青少年糖尿病，但也可以在成年患者中檢測到T1DM。

T1DM主要是通過破壞胰島β細(xì)胞，使得胰島素分泌減少，導(dǎo)致DM的發(fā)生。在非肥胖DM小鼠、人類胰島素依賴型DM小鼠模型，自發(fā)性DM中使用1,25(OH)2D3或其類似物的許多試驗(yàn)中已經(jīng)證明了這一點(diǎn)[11]。相反，1,25(OH)2D3抗性小鼠發(fā)生DM的風(fēng)險較高，在生命早期存在缺陷時更具侵略性[12]。早期使用的1,25(OH)2D3通過對胰島β細(xì)胞和免疫細(xì)胞的雙重作用來預(yù)防或減輕胰腺胰島炎的嚴(yán)重性[13]。此外，在自身免疫性疾病發(fā)作(稱為前驅(qū)DM狀態(tài))后，使用1,25(OH)2D3與環(huán)孢菌素A可以預(yù)防DM的發(fā)生。DM患者維生素D缺乏的可能機(jī)制之一是結(jié)合蛋白減少，這已經(jīng)在DM大鼠中得到證實(shí)[14]。Mathieu等[15]證明活性VitD可阻止動物模型中的T1DM。然而，VitD是否能夠減少由H2O2誘導(dǎo)的小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚未完全清楚，需進(jìn)一步研究。

Fig 5 Effect of H2O2 alone and pretreatment with VitD on expression of apoptosis-related proteins

細(xì)胞凋亡是一種基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程，也稱為程序性細(xì)胞死亡，發(fā)生在所有活細(xì)胞中并受基因調(diào)控，其特征是一系列細(xì)胞形態(tài)變化，包括染色體濃縮，核碎裂，細(xì)胞皺縮，形成凋亡小體等。兩種不同的死亡信號通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡：外在死亡受體依賴途徑和內(nèi)在的線粒體依賴途徑。對于內(nèi)在的線粒體依賴性途徑，細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)中是凋亡小體形成和Caspase-3激活的基礎(chǔ)。在Bcl-2家族中，Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白。 Bax或Bcl-2可以控制線粒體通透性并促進(jìn)細(xì)胞色素c的通過。因此，Bax/Bcl-2比率決定了許多細(xì)胞的命運(yùn)。 Bax和Bcl-2蛋白的失衡可能導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失和細(xì)胞色素c的釋放，從而引發(fā)Caspase-3活化并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)選用小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞，首先通過CCK-8法檢測H2O2對MIN6細(xì)胞活力的影響。然后用VitD預(yù)處理，結(jié)果表明，與單獨(dú)的H2O2處理組比，VitD預(yù)處理后用H2O2處理，MIN6細(xì)胞活力顯著增加。然后用Hoechst 33258染色細(xì)胞核，觀察細(xì)胞核形態(tài)，VitD預(yù)處理后用H2O2處理，與單獨(dú)的H2O2處理組比，染色質(zhì)固縮的細(xì)胞明顯減少，接著采用流式細(xì)胞術(shù)通過Annexin V-FITC/PI 2種熒光染料共染色MIN6細(xì)胞，檢測細(xì)胞凋亡率。VitD預(yù)處理后用H2O2處理細(xì)胞凋亡百分率顯著低于單獨(dú)的H2O2處理組。Western blot結(jié)果顯示，單獨(dú)的H2O2處理Bcl-2表達(dá)降低，Bax、Cleaved caspase-3 表達(dá)增加，VitD預(yù)處理后用H2O2處理Bcl-2表達(dá)增加，Bax、Cleaved caspase-3 表達(dá)降低。

綜上所述，VitD通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax及Cleaved caspase-3表達(dá)，減少由H2O2誘導(dǎo)的小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞凋亡，減少DM的發(fā)生，從而為T1DM的防治提供新的思路和途徑。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在糖尿病分子機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)室完成，感謝老師及同學(xué)的支持與幫助。)