依普利酮抑制鹽皮質激素受體活化減緩梗阻性腎病細胞自噬的研究

柴亞男，馬雪蓮,2，郝 娟，張雨軒，趙綺悅，高曉萌，許慶友,2

(1. 河北中醫學院研究生學院，2. 河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

梗阻性腎病是指由于泌尿道結構和(或)功能改變，尿液排泄障礙所致的腎實質病變及功能損害，是導致腎功能衰竭的常見病因。我國腎臟病監測網絡2019年發布的關于2015年腎臟病數據報告顯示，在慢性腎臟病的諸多病因中，梗阻性腎病已升至第3位，且是農村居民發病的首位病因[1]，所以解析其發病機制對于治療梗阻性腎病有重要意義。前期研究證明，單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)可激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)，誘導醛固酮活化，進而激活鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)，導致細胞增殖[2]等病理改變，依普利酮(eplerenone,EPL)可以阻斷這一進程，但是對細胞自噬影響的研究尚少。細胞自噬是真核細胞生物通過溶酶體降解受損的大分子蛋白和細胞器，從而轉換為能量供機體重新利用，以維持細胞內環境穩態的過程，然而在持續或強烈應激刺激下，自噬被過度激活而造成細胞自噬性死亡。有研究報道，UUO可激活自噬，隨著時間的變化發揮不同的作用[3]，也有研究表明在糖尿病腎病中，醛固酮阻斷劑螺內酯可通過阻斷MR活化，促進細胞自噬的表達，從而保護腎臟[4]。本實驗采用UUO模型模擬梗阻性腎病的發病機制及病理改變，觀察鹽皮質激素受體阻斷劑EPL對NR3C2、血清和糖皮質激素誘導的蛋白激酶-1(serum and glucocorticoid-induced protein kinase 1，SGK-1)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)、自噬相關基因5(autophagy associated gene 5，Atg5)、Beclin-1和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubular-associated protein 1 light chain 3，LC3)的調控作用，探討EPL對梗阻性腎病細胞自噬的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組♂清潔級Wistar大鼠36只，體質量(180±20)g，購自河北醫科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(冀)1205069。隨機分為假手術組(Sham group)、模型組(UUO group)和依普利酮組(UUO+EPL group)。

1.1.1藥物 EPL選用美國Pfizer公司產品，日本Research Diets.Inc公司根據動物進食量及藥物用量(100 mg·kg-1·d-1)，按1.25 g·kg-1加入飼料中。

1.1.2試劑 NR3C2(Proteintech公司，批號00016122)，SGK-1(Affinty公司，批號19U71)，Atg5(Proteintech公司，批號00020300)，Beclin-1(Proteintech公司，批號00053036)，mTOR(Cell Signaling Technology公司，批號00042580)，p-mTOR(Cell Signaling Technology公司，批號0021)，LC3(Cell Signaling Technology公司，批號0003)，GAPDH(Bioworld Technology公司，批號AB54162)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號 K185910G)。

1.1.3儀器 Leica RM 2245型石蠟切片機(德國 Leica上海分公司)，Leica SP8激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，電泳儀及電泳槽(北京六一公司)，OLYMPUS VANOX PM-10AD型顯微照相儀(日本 OLYMPUS 公司)，VANOX DM-10AD顯微鏡(日本OLYMPUS株式會社)，ODY-3059掃描儀(美國Li-cor公司)。

1.2 造模方法及給藥實驗大鼠適應性喂養1周后，通過UUO建立梗阻性腎病的動物模型，用10%的水合氯醛以3 mL·kg-1的劑量通過腹腔注射麻醉動物，假手術組于左側中腹部切開皮膚，僅將輸尿管游離但不結扎不切斷，逐層縫合皮膚；模型組和依普利酮組于左側中腹部切開皮膚，游離左側輸尿管，分別在輸尿管上1/3及下1/3處用絲線結扎后切斷輸尿管，逐層縫合皮膚。治療組給予依普利酮100 mg·kg-1·d-1。10 d后處死動物，摘取梗阻側的腎臟，一部分組織放入4%多聚甲醛中固定，剩余組織-70 ℃保存待測。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1激光共聚焦顯微鏡檢測NR3C2的表達 厚5 μm腎組織冰凍切片，NR3C2抗體(1 ∶100)孵育過夜，PBS清洗后滴加TRITC標記的二抗孵育1 h，PBS清洗后DAPI染核后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察NR3C2的表達。

1.3.2免疫組化檢測SGK-1、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3的表達 采用SABC法檢測，石蠟切片脫蠟，梯度脫水，修復抗原，滴加一抗SGK-1、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜；PBS清洗后二抗孵育1 h，滴加SABC復合物，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片，以光鏡下出現棕黃色顆粒為陽性表達。

1.3.3Western blot檢測SGK-1、mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3的表達 取冰凍腎組織100 mg,加裂解液(含蛋白酶抑制劑)0.4 mL，提取蛋白并測定含量，配制相應濃度的濃縮膠和分離膠，加入上樣蛋白，電泳后轉膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入SGK-1、mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3抗體(1 ∶1 000)，4 ℃過夜，次日TBS清洗3次，加入相應二抗(1 ∶20 000)孵育，TBS清洗3次，顯影，與內參進行校正。

2 結果

2.1 激光共聚焦顯微鏡檢測NR3C2表達NR3C2在假手術組表達于腎小管遠端上皮細胞的胞質，核內未見表達；與假手術組相比，模型組表達明顯增強，主要見于細胞核；依普利酮組NR3C2在細胞核內表達明顯減弱(Fig 1)。

Fig 1 Expression of NR3C2 by laser confocal microscopy (×630) A：Sham;B:UUO;C:UUO+EPL

2.2 免疫組化檢測SGK-1表達SGK-1在假手術組呈弱表達，主要見于遠端腎小管；模型組表達明顯增強而依普利酮組SGK-1表達明顯減弱(Fig 2)。

Fig 2 Expression of SGK-1 in rats by immunohistochemistry (×400)

A：Sham;B:UUO;C:UUO+EPL

2.3 免疫組化檢測p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3表達p- mTOR在假手術組呈陽性表達，見于腎小管上皮細胞的胞質；模型組p-mTOR表達明顯減弱，依普利酮組表達較模型組增強(Fig 3)。

Atg5和Beclin-1在假手術組呈弱表達，均見于腎小管上皮細胞的細胞質；模型組表達明顯增強；依普利酮治療后Beclin-1和Atg5的表達明顯減弱(Fig 3)。

LC3在假手術組呈弱表達，見于腎小管上皮細胞的細胞質和細胞膜；模型組表達明顯增強，以腎小管上皮細胞的細胞膜為主要表達部位；依普利酮組表達明顯減弱(Fig 3)。

Fig 3 Expression of p-mTOR, Atg5, Beclin-1, LC3 in rats by immunohistochemistry (×400)

2.4 Western blot檢測SGK-1、mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3蛋白表達采用Western blot檢測SGK-1、Atg5、Beclin-1的蛋白表達，結果經內參校正后顯示：與假手術組相比，模型組SGK-1、Atg5和Beclin-1表達明顯增強(P<0.05)，與模型組相比，依普利酮組表達明顯減弱(P<0.05)(Fig 4,Tab 1)。

Tab 1 Expression of SGK-1, Atg5, Beclin-1 in rats by Western blot n=4)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsUUO

采用Western blot檢測LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ，mTOR和p-mTOR的蛋白表達，結果顯示與假手術組相比，模型組LC3 Ⅱ/Ⅰ明顯增強(P<0.05)，依普利酮可以糾正其比例(P<0.05)；p-mTOR/mTOR在假手術組表達基本相同，p-mTOR、mTOR以及比值在模型組表達明顯減弱(P<0.05)，依普利酮可以糾正其失衡(P<0.05)(Fig 4,Tab 2)。

Tab 2 Protein expression of p-mTOR and LC3 in rats by Western blot n=4)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsUUO

3 討論

輸尿管梗阻導致腎臟壓力增高，血管中有效循環血容量下降，從而激活RAAS，刺激醛固酮分泌增多，誘導MR活化，繼而發揮病理生理作用。MR屬于核受體超家族，主要在腎臟遠端腎單位的上皮細胞中，包括遠曲小管、主細胞和閏細胞的連接小管及集合管[5]。醛固酮的作用不單是調節水鹽平衡，在高血壓、炎癥損傷、氧化應激等方面也發揮著重要作用。

鹽皮質激素受體NR3C2是配體依賴的轉錄因子，在生理狀態下與伴侶蛋白熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)結合，主要存在于細胞質，當受到醛固酮等刺激后，與HSP分離，進入核內，進而發揮促炎、促氧化應激等一系列病理生理作用。此外，Rac1以及氧化應激等都可以誘導MR活化并通過不同方式發揮作用，如通過L型鈣通道引起高血壓[6]、通過ENaC蛋白通道導致鹽敏感性高血壓[7]、通過炎癥反應誘導臟器損傷[8]等。當MR被激活之后，其效應介質SGK-1表達明顯增強[9]，觀察其表達對于研究醛固酮是否與MR結合并誘導氧化應激、炎性損傷和腎間質纖維化的程度及治療有重要的參考作用。

依普利酮是一種新型的鹽皮質激素受體拮抗劑，不良反應小，耐受性好，對雄激素和黃體酮受體的親和力極低，能有效抑制MR活化，進而抑制由其帶來的細胞增殖、表型轉化、凋亡等病理改變，保護腎功能。本實驗結果顯示UUO后NR3C2表現為核轉位，SGK-1表達增強，依普利酮可以抑制NR3C2活化和SGK-1的表達。

Atg5是自噬溶酶體降解途徑中的重要調節基因，Atg5與Atg12形成的蛋白復合物Atg5-Atg12，通過與Tecpr1結合促進自噬體與溶酶體的融合，而在缺失Atg5的細胞中，這一過程無法正常進行[10]。在自噬體的延伸階段，Atg5、Atg12和Atg16結合形成三元復合物并與自噬體外膜結合，不僅促進自噬泡的延伸和擴張，使自噬泡由開始的小囊泡發展為半環狀結構；還促進了LC3向自噬泡募集，參與自噬泡膜的彎曲，促進自噬的進展[11]。此外，Atg5作為細胞自噬和凋亡的轉換開關，在自噬的發生和發展中起重要的調控功能[12]。Beclin-1是自噬啟動的必需基因，通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(ⅢPI3K)結合形成Beclin1-ⅢPI3K復合物，調節自噬的水平。Beclin-1是第1個被發現的參與自噬對疾病調控的自噬基因，在自噬溶酶體降解途徑中對腫瘤有抑制作用[13]。LC3是自噬體膜的重要標記物，以LC3I和LC3 Ⅱ兩種形式存在，LC3在羧基端被具有蛋白內切酶活性的Atg4剪切，生成存在于細胞質的LC3I；LC3I通過Atg7和Atg3參與的泛素樣反應，使磷脂酰乙醇胺偶聯，生成脂質化形式的LC3 Ⅱ；LC3 Ⅱ是自噬體的結構蛋白，可以附著到自噬體膜上，通過監測LC3I向LC3 Ⅱ的轉化可以檢測自噬的進展[14]，所以通常用Western blot檢測LC3 Ⅱ/I或mRFP-GFP-LC3雙熒光實驗評估自噬的表達。mTOR是自噬的負調控通路，通過磷酸化激活下游的激酶，調節細胞的生長分化、增殖、自噬等過程。mTOR激酶是細胞能量和營養代謝的感受器，當機體處于營養充足的環境時，mTOR可以抑制自噬；當機體處于缺血缺氧等病理條件下，mTOR激酶活性受到抑制，自噬被激活[15]。本實驗結果表明UUO后Atg5、Beclin-1、LC3表達增強，p-mTOR表達減弱，依普利酮可調控這一過程，減緩梗阻性腎病中細胞自噬的表達。

本實驗采用UUO制備梗阻性腎病的動物模型，激活RAAS，誘導MR活化，觀察依普利酮對梗阻性腎病細胞自噬的影響，結果表明，依普利酮可抑制MR活化，減弱自噬基因和蛋白表達，減緩梗阻性腎病病理進展。

(致謝:衷心感謝河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室各位老師的支持與幫助！)