小檗堿通過TGF-β/Smad通路抑制TGF-β1誘導的人肝癌HepG2細胞上皮間質轉化的研究

陳春苗，張國哲，劉平平，火躍芳，李廷利

(1. 江蘇醫藥職業學院藥學院，江蘇 鹽城 224005；2. 黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

肝癌是肝臟的一種惡性腫瘤，是世界上最常見的癌癥類型之一，也是目前癌癥死亡的第三大原因，占癌癥導致死亡率的8.2%[1]。90%以上與癌癥相關的死亡是由癌細胞轉移導致的，肝癌的遠處轉移也是晚期患者死亡的首要原因[2]。越來越多的研究表明[3-4]，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的發生發展、耐藥、侵襲、轉移有著密切的聯系，EMT主要是指在特定的腫瘤微環境下，極性較強的上皮細胞來源的腫瘤細胞向侵襲性和轉移性更強的間質細胞轉化的生物學過程，此過程可以促進腫瘤組織中的腫瘤細胞向遠處組織浸潤和轉移。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前研究最廣泛和最有效的EMT誘導因子之一，其可以消除細胞間黏附作用及改變細胞形態，促進間質表型轉化，誘導癌細胞發生EMT[5]。

小檗堿(berberine)屬于異喹啉類生物堿，主要存在于小檗科、毛莨科、蕓香科、罌粟科和防己科等藥用植物中，其毒副作用小, 應用前景極其廣闊，臨床上廣泛用于治療胃腸炎、細菌性痢疾等疾病，近年來研究發現小檗堿還具有明顯的降糖、調血脂、保護心血管、抗腫瘤等藥理作用[6]。小檗堿以往的抗腫瘤研究報道主要集中于其抑制腫瘤細胞增殖，以及誘導腫瘤細胞凋亡等方面，但是對于小檗堿能否抑制TGF-β1誘導的肝癌HepG2細胞遷移、侵襲和EMT的作用及其機制仍未見報道。本研究旨在探討小檗堿對TGF-β1誘導的HepG2細胞EMT的影響，以及TGF-β/Smad信號通路在此過程中的作用。

1 材料

1.1 細胞系人肝癌HepG2細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 藥物與試劑鹽酸小檗堿(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201814)； DMEM高糖培養基、胰蛋白酶、胎牛血清FBS(美國Gibco公司)；DMSO、MTT(美國Sigma公司)；TGF-β1(美國PeproTech公司)；Transwell小室(美國BD公司)；DPAI細胞核染色液、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；兔源一抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、 MMP-2、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、GAPDH(美國CST公司)；羊抗兔IgG二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；PVDF膜、ECL化學發光液(美國Millipore公司)。

1.3 儀器FORMA 371型CO2細胞培養箱(美國Thermo Fisher 公司)； AE2000 型顯微鏡(中國Motic公司)；iMark型酶標儀、Powerpac300型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Tanon-5200 型全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡LCM 880(德國ZISS公司)。

2 方法

2.1 細胞培養與給藥人肝癌HepG2細胞培養于含10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置 37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。小檗堿用DMSO溶解配置成母液，給藥時用DMEM 高糖完全培養基稀釋成不同濃度。根據文獻報道[7]，采用10 ng·L-1TGF-β1孵育HepG2細胞誘導EMT形成。

2.2 MTT實驗檢測HepG2細胞活力將處于對數生長期的HepG2細胞以每孔約3×103個細胞100 μL接種于96孔板中，培養過夜，在96孔板中加入不同濃度小檗堿，每組6個復孔，培養24 h、48 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，培養4 h后，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床低速振搖10 min，在酶標儀490 nm處測定各孔吸光度，計算并繪出各組細胞活力柱狀圖。

2.3 克隆形成實驗檢測HepG2細胞克隆形成能力將處于對數生長期的HepG2 細胞以每孔細胞數約為1×103個接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿，培養大約2周后，每孔加入4%的多聚甲醛固定，然后加入0.1%的結晶紫染色，沖洗干凈，拍照，計算各組細胞克隆數量。

2.4 細胞劃痕實驗檢測HepG2細胞遷移能力將處于對數生長期的HepG2細胞以每孔細胞數約為5×105個接種于6孔板中，待細胞融合度達85%左右后，用10 μL的移液槍在每孔劃出3道豎線，PBS洗去被劃下的細胞，之后在6孔板中加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿，記為0 h，放入培養箱繼續培養24 h；并用倒置顯微鏡觀察和拍攝各組細胞0 h和24 h細胞劃痕的狀態。

2.5 Transwell實驗檢測HepG2細胞侵襲能力將帶Matrigel膠的Transwell小室放于24孔板中，取對數生長期的HepG2細胞用含1%胎牛血清的高糖DMEM培養基制成細胞懸液，Transwell小室上室加入3×104個細胞200 μL含不同濃度的小檗堿培養基，Transwell下室中加入含15%胎牛血清和10 ng·L-1TGF-β1的DMEM高糖培養基800 μL，培養48 h；4%多聚甲醛固定后，用棉簽輕輕擦去Transwell上室中的Matrigel膠和細胞，倒置顯微鏡下觀察Transwell下室中各組細胞侵襲情況，隨機選擇 5個視野計算穿膜細胞數。

2.6 免疫熒光實驗檢測HepG2細胞EMT標記物將細胞爬片置于12孔板中，將處于對數生長期的HepG2細胞以每孔細胞數約為2×104個接種于爬片上，待細胞貼壁后，加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿培養48 h后，4%多聚甲醛固定，加入含0.3% TritonX-100的10% BSA封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，加入DAPI 染色10 min，熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

2.7 Western blot實驗檢測目的蛋白的表達將處于對數生長期的HepG2細胞以每孔約為3×105個接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿培養48 h后，用預冷的PBS洗2遍，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，吸至1.5 mL的EP管中，4 ℃離心10 min，采用BCA試劑盒定量蛋白濃度。使用10%的SDS-PAGE分離蛋白樣品，濕轉膜法轉到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，化學發光法顯影，運用全自動化學發光圖像分析系統對蛋白條帶進行分析，檢測蛋白表達情況。

3 結果

3.1 小檗堿對HepG2細胞活力的影響如MTT結果所示(Fig 1)，與正常對照組相比，低濃度(1～4 μmol·L-1)小檗堿處理HepG2 細胞24 h、48 h后，HepG2細胞活性沒有變化，小檗堿濃度增加至8～64 μmol·L-1時，可以呈濃度-時間依賴性抑制HepG2細胞活性(P<0.05，P<0.01)。為排除小檗堿對TGF-β1誘導的遷移侵襲和EMT的影響是由抑制HepG2 細胞活性所造成的，因此，選擇殺傷作用較弱的小檗堿濃度(1、2、4 μmol·L-1)開展后續EMT實驗研究。

3.2 小檗堿對TGF-β1誘導的HepG2細胞克隆形成能力的影響克隆形成實驗結果顯示(Fig 2)，TGF-β1處理的HepG2 細胞的克隆數量明顯比正常組多(P<0.01)；與TGF-β1模型組對比，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預后，HepG2細胞的克隆數量明顯減少(P<0.01)。實驗結果表明了小檗堿可以顯著減弱TGF-β1增加的HepG2細胞克隆形成能力。

Fig 1 Effect of berberine on viability of HepG2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.3 小檗堿對TGF-β1誘導的HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響癌細胞發生EMT進程中，其會獲得更強的遷移和侵襲能力，劃痕和Transwell小室實驗結果所示(Fig 3)，與正常組相比，TGF-β1可以明顯增加HepG2細胞的遷移和侵襲能力(P<0.01)；與TGF-β1模型組對比，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預后，HepG2細胞的遷移和侵襲能力減弱(P<0.05)。這些結果表明小檗堿能有效抑制TGF-β1增強的HepG2細胞遷移和侵襲能力。

3.4 小檗堿對TGF-β1誘導的HepG2 細胞EMT標志物蛋白的影響Western blot檢測結果顯示(Fig 4)，與正常組對比，TGF-β1明顯減弱了HepG2細胞中上皮標記物 E-cadherin蛋白的表達水平，增加了間質標記物和轉錄因子N-cadherin、Snail、 MMP-2蛋白的表達水平(P<0.01)；與TGF-β1模型組對比，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預后，N-cadherin、Snail、 MMP-2蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白的表達水平增加(P<0.01)。如Fig 5激光共聚焦顯微鏡觀察的結果所示，與正常組相比，TGF-β1明顯增加了EMT間質標記物Vimentin綠色熒光的表達；而4 μmol·L-1小檗堿則明顯降低了TGF-β1增加的Vimentin綠色熒光表達水平。這些結果證實了小檗堿可以有效地逆轉TGF-β1誘導的肝癌HepG2細胞EMT的變化。

3.5 小檗堿對TGF-β1誘導的HepG2 細胞TGF-β/Smad通路的影響相關研究報道表明，TGF-β1可以激活Smad通路促進癌細胞形成EMT[8]。如Fig 6中Western blot檢測結果顯示，與正常組比較，TGF-β1增加了HepG2細胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達水平(P<0.01)，Smad2、Smad3總蛋白水平不變；與TGF-β1模型組比較，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預后，p-Smad2、p-Smad3蛋白表達水平下降(P<0.05)。實驗結果表明了小檗堿可以通過TGF-β/Smad信號通路逆轉TGF-β1誘導的EMT轉化。

4 討論

肝癌早期癥狀通常較為隱匿，多數患者早期幾乎沒有明顯癥狀，但一旦出現相關癥狀前往就診時，多數患者已經是中晚期，此時肝癌細胞已經發生轉移，出現多個病灶，轉移是癌癥患者臨床預后不良的重要原因之一，也是大多數患者死亡的重要原因[9]。癌細胞發生轉移時，往往會伴隨著EMT的過程，即癌細胞的表型發生了明顯的變化，在此過程中，其上皮細胞的表型標志物蛋白表達會逐漸喪失，如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，緊密連接蛋白-1(Zonula Occludens-1)等，同時癌細胞的間質標志物蛋白增加，如N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)等，肝癌細胞經過EMT后細胞間黏附能力下調, 遷移侵襲能力上調, 從而使肝癌細胞向局部組織中浸潤, 通過血管或者淋巴管轉移到遠處的、骨組織等, 最終導致腫瘤患者死亡[10-11]。因此，研究肝癌侵襲轉移的作用機制，找出一種毒性較低抑制肝癌細胞EMT的天然藥物，對臨床輔助治療肝癌及改善臨床預后具有重要的意義。相關研究表明[12-13]，小檗堿具有較強的抗腫瘤活性，可以誘導多種腫瘤細胞凋亡及抑制癌細胞轉移。因此，本實驗旨在進一步研究小檗堿是否可以抑制TGF-β1誘導的HepG2細胞EMT，及其相關作用機制。

Fig 2 Effect of berberine on TGF-β1-induced clonogenic potential of HepG2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group

Fig 3 Effect of berberine on TGF-β1-induced migration (A) and invasion (B) of HepG2

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1 group

Fig 4 Effect of berberine on protein expression of E-cadherin, N-cadherin, Snail, MMP-2 induced by TGF-β1 in HepG2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group

Fig 5 Effect of berberine on Vimentin expression induced by TGF-β1 in HepG2 cells determined by confocal microscopy

Fig 6 Effect of berberine on TGF-β/ Smad pathway in HepG2

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1 group

實驗中為了排除較高濃度的小檗堿對HepG2細胞的殺傷作用，干擾到小檗堿抑制TGF-β1誘導的HepG2細胞遷移、侵襲和EMT，可能是由于小檗堿對HepG2細胞本身的殺傷作用，而不是小檗堿作用于TGF-β1所導致的；因此本實驗首先通過MTT實驗，篩選對HepG2細胞殺傷作用較弱的小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)濃度，進行后續EMT相關實驗。實驗結果表明，低濃度的小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)可以明顯抑制TGF-β1增強的HepG2細胞的克隆形成能力、遷移和侵襲能力；

TGF-β1作為一種有效的EMT誘導劑，在多種高表達TGF-β的腫瘤中，其可以通過自分泌和旁分泌的方式作用于細胞膜上的Ⅱ型受體(TβRⅡ)，并且磷酸化膜上的Ⅰ型受體(TβRⅠ)，激活胞質內的Smad通路，磷酸化的Smad 2與Smad 3再與Smad4 結合形成復合體進入細胞核中，激活轉錄因子Snail、 ZEB、Twist后，便可抑制上皮標志物E-cadherin蛋白表達，上調間質標志物N-cadherin等蛋白表達，促進EMT的形成[5,14]。研究表明，10 ng·L-1TGF-β1可以通過Smad信號通路上調Snail轉錄因子，促進肝癌細胞的EMT[7]；多數腫瘤細胞發生侵襲或者EMT時會伴隨分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，如 MMP-2，其可以溶解細胞外基質、基底膜、血管內壁等，促進腫瘤細胞從原發灶向其他組織部位浸潤轉移[15]。本研究通過Western blot和激光共聚焦實驗首次發現，小檗堿可以降低TGF-β1誘導的Smad信號通路，抑制p-Smad2和p-Smad的表達，以及降低了TGF-β1上調的間質標志物N-cadherin、Vimentin、Snail、 MMP-2蛋白表達，并且增加了TGF-β1下調的上皮標志物E-cadherin蛋白表達，實驗結果表明，小檗堿逆轉了TGF-β1誘導的HepG2細胞EMT，使其發生了MET(mesenchymal-epithelial transition，即間質上皮轉化)。

綜上所述，小檗堿可抑制TGF-β1誘導的肝癌細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能是通過調控TGF-β/Smad信號通路，抑制EMT的形成而實現的，這些初步研究為小檗堿在肝癌分子靶向治療的開發利用提供新的理論依據。