加味丹參飲結合miR-21對缺血再灌注損傷心肌細胞的影響研究

吳若霞，李正陽，任 婷，童巧珍，黃政德，黃新艷，田雪飛,3

(1.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙 410208；2.衡陽市中醫醫院腎病科，湖南 衡陽 421001；3. 中醫方證研究轉化醫學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208)

《中國心血管病報告2017》指出，預計到 2030年以后，冠心病有可能成為人類死亡的首位原因，嚴重危害人類的健康，因此，積極有效地防治冠心病尤為重要[1]。冠心病的主要癥狀是心絞痛，主要是由心肌缺血、缺氧引起的發作性胸痛或胸部不適。心肌缺血再灌注損傷的分子機制是非常復雜的，包括氧化應激、細胞內Ca2+超載、再灌注后生理PH的不穩定、線粒體通透性增加導致的炎癥加重等等都可以引發缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,IRI)[2]。

微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛參與調控多種細胞功能，是一類高度保守的長度約為18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過多種機制(如mRNA 切割和翻譯抑制)參與功能基因的轉錄后調控[3-4]。其中，miRNA-21(miR-21)表現出抗凋亡作用，在心、腎等組織中的抗凋亡作用更為明顯[5]。最新研究發現， miR-21 在緩解心肌梗死[6]、心肌缺血再灌注[7,8]等多種心血管疾病中發揮積極作用。目前miR-21聯合中醫藥治療心肌IRI的報道較少。本研究將通過在心肌細胞中轉染miR-21促進其表達，并與加味丹參飲含藥血清共孵育，以進一步研究加味丹參飲對心肌細胞的保護機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象H9C2心肌細胞購于中國科學院細胞庫；SD大鼠，♂，8～10周，體質量(200±20)g，40只，湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 試劑和藥物胰酶，DMEM，胎牛血清，青霉素鏈霉素雙抗，均購于GIBCO；加味丹參飲(Jia Wei Dan Shen Yin,JWDSY)，購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科；MTT(貨號：PAB180013)購自bioswamp公司；大鼠心肌肌鈣蛋白I(cTNI)檢測試劑盒(貨號：RA20647)購自bioswamp公司；AnnexinV-PE/7 AAD 凋亡檢測試劑盒(貨號：559763)購自BD公司；PTEN兔單克隆抗體、Akt兔單克隆抗體均購于Abcam公司；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒，購于東洋紡生物科技有限公司；pGC-FU-micro RNA-21-GFP載體購于上海吉凱基因化學有限公司；感染試劑Polyethylenimine(PEI) 購自Polysciences；TRIzol提取總RNA試劑購于Invitrogen；感受態細胞購于北京莊盟。

1.3 儀器多功能酶標儀(瑞士Tecan公司產品)；熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司產品)；凝膠成像儀(美國Amersham Imager公司產品)；電子顯微鏡(德國蔡司公司)；二氧化碳培養箱(美國賽默飛世爾公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1慢病毒表達載體構建 采用直接合成的方法獲得目的基因序列(TGTACCACCTTGTCGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGTTGAATCTCAT-GGCAACAGCAGTCGATGGGCTGTCTGACATTTTGG-TATC)，上下游分別加酶切位點 Xba I、 BamH I。將載體經雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，與雙鏈DNA oligo于4 ℃ 12 h連接反應制備克隆連接液，轉化stlb3感受態細胞后進行陽性克隆PCR鑒定。

1.4.2病毒包裝穩定轉染 細胞293T細胞密度為5×108cells/孔，接種于D60 mm培養皿中，37 ℃、5% CO2培養箱內培養。質粒與PEI轉染試劑1 ∶3且加入200 μL培養基(DMEM+10%FBS，無雙抗)混合均勻，室溫下溫育10 min。期間293T細胞換液(DMEM+10% FBS，無雙抗)，再取200 μL培養基(DMEM+10%FBS，無雙抗)與上述質粒混合物混勻，將質粒混合液滴入293T細胞的培養液中，混勻，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。培養8 h后倒去含有感染混合物的培養基，換入正常培養基(DMEM+10% FBS+1%雙抗)于37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養，48 h和72 h收集感染后293T細胞上清液，0.45 μm濾器過濾上清液即病毒，收集好的病毒感染H9C2細胞。

1.4.3H9C2心肌細胞IRI模型的建立 H9C2心肌細胞于不含抗生素及血清的DMEM培養基中培養，置于37℃，CO2-O2-N2(3 ∶2 ∶95)缺氧環境細胞培養箱中培養10 h，然后再于O2-CO2(95 ∶5)有氧正常環境培養箱中培養2 h，隨后將細胞取出進行后續實驗。

1.4.4含藥血清的制備 取40只SD大鼠隨機分為空白組和藥物組，分別灌胃用以制備空白血清和藥物血清。藥物組用加味丹參飲灌胃獲得含藥血清，5.94 g·kg-1，每日2次，連續灌胃3 d。空白組用等量生理鹽水灌胃獲得空白血清。均于最后1次給藥后1 h，無菌條件下，真空采血管腹主動脈取血，分離血清冷凍備用。

1.4.5實驗分組 (1)空白組(Control)：正常H9C2心肌細胞。(2)模型組(Model group)：經IRI造模后的H9C2心肌細胞，與空白血清共孵育24 h。(3)miR-21組(miR-21 group)：將pGC-FU-micro RNA-21-GFP 慢病毒載體轉染入H9C2心肌細胞后進行IRI造模，加入空白血清共孵育24 h。(4)JWDSY組(JWDSY group)：將pGC-FU-micro RNA-21-GFP 慢病毒載體轉染入H9C2心肌細胞后進行IRI造模，加入加味丹參飲含藥血清共孵育24 h。

1.4.6檢測方法 電鏡觀察細胞超微結構的影響 各組細胞于室溫下以 PBS清洗 2～3次，4 ℃ 2 000 r·min-1離心15 min手機細胞。用2.5%戊二醛溶液固定4 h；PBS清洗，用1%鋨酸溶液處理2 h；細胞移至EP管中，PBS清洗，乙醇梯度脫水，再以丙酮、環氧樹脂812包埋劑處理，半薄切片定位、超薄切片(厚度約 60 nm)，經飽和醋酸鈾溶液避光染色、水洗、烘干后再用枸櫞酸鉛避光染色，雙蒸水洗去多余鉛液，濾紙吸干后，于透射電子顯微鏡下觀察心肌細胞超微結構并拍照。

ELISA檢測心肌損傷指標 取各組大鼠腹主動脈血，裝入離心管，離心機3 000 r·min-1離心15 min后，取血清置于1.5 mL離心管中。采用ELISA法檢測cTnI水平。

流式細胞術檢測心肌細胞凋亡 各組細胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化各組細胞并得到單細胞懸液，PBS洗2次后，收集(1～5)×105個細胞，加入500 μL結合緩沖液懸浮細胞，之后分別加入5 μL annexinV-FITC及5 μL PI混勻，室溫避光反應5～15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡，具體操作步驟按說明書進行。

蛋白免疫印跡實驗檢測PTEN、P-Akt蛋白的表達量 細胞蛋白提取后，經BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，凝膠電泳分離后將蛋白轉移到SDS-PAGE膜上，5%脫脂奶粉封閉，進行一抗過夜孵育，再用辣根過氧化物酶偶聯抗兔IgG進行二抗孵育，ECL發光液進行顯影分析。

2 結果

2.1 慢病毒感染H9C2細胞在熒光顯微鏡下觀察轉染48后熒光表達情況，可以觀察到綠色熒光，慢病毒載體成功轉染H9C2細胞。見Fig 1。

Fig 1 Green fluorescent signal of H9C2 cells infected by lentivirus(×40)

(H9C2 cells had adhered to the wall,and their morphology changed from round to columnar,spindle and polygonal. The expression of green fluorescence was obvious under fluorescence inversion microscope.)

2.2 miR-21聯合加味丹參飲對H9C2心肌細胞超微結構的影響Fig 2透射電鏡觀察結果顯示，空白組正常H9C2細胞的超微結構清晰，細胞膜完整，線粒體包膜完整，細胞結構正常。模型組細胞有明顯損傷表現，造模成功，線粒體腫脹，空泡化，邊界模糊不清；miR-21組與模型組比較，細胞損傷有所減輕，JWDSY組損傷減輕的程度更為明顯，部分線粒體腫脹，細胞膜完整，大部分線粒體結構清晰，空泡化程度明顯減輕，提示miR-21聯合加味丹參飲對細胞IRI有明顯的保護作用。

Fig 2 Effect of JWDSY combined with miR-21 on ultrastructure of myocardial cells(×50 000)

A. Cell ultrastructure was clear; B. Mitochondrial swelling,vacuolation,blurred boundary; C. Mitochondrial swelling was reduced; D. Ultrastructure was clear,and the degree of vacuolation was significantly reduced.

2.3 miR-21聯合加味丹參飲對IRI心肌細胞cTnI表達的影響ELISA法檢測各組細胞cTnI表達，結果顯示，與空白組比較，模型組細胞中cTnI升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，miR-21組和JWDSY組中細胞cTnI水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，且JWDSY組cTnI降低更為明顯。各組cTnI水平檢測結果見Fig 3。

Fig 3 Effect of miR-21 combined with JWDSY on expression of cTnI in

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsmiR-21

2.4 miR-21聯合加味丹參飲對IRI心肌細胞凋亡的影響根據流式細胞凋亡檢測結果顯示，與空白組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，miR-21組和JWDSY組細胞凋亡率均下降，差異有統計學意義(P<0.05)，且JWDSY組下降程度更為明顯。各組細胞的凋亡情況見Fig 4，凋亡率檢測結果見Tab 1。

Fig 4 Effect of miR-21 combined with JWDSY on apoptosis

Tab 1 Effect of miR-21 combined with JWDSY on apoptotic rate of myocardial

GroupApoptotic rate/%Control2.56±0.13Model36.79±2.16*miRNA-2126.43±1.10*#JWDSY14.65±1.07△#*

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsmiR-21

2.5 miR-21聯合加味丹參飲對PTEN與P-Akt表達的影響經Western blot分析，IRI處理后H9C2細胞的PTEN蛋白表達增強，P-Akt蛋白表達減弱，miR-21組恢復這種異常表達，進而加入含藥血清的JWDSY組，又進一步降低了PTEN的表達，同時升高了P-Akt的表達。差異具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 5，Tab 2。

Fig 5 Effect of miR-21 combined with JWDSY on expression of PTEN and

Tab 2 Effect of miR-21 combined with JWDSY on expression of PTEN and

Tab 2 Effect of miR-21 combined with JWDSY on expression of PTEN and

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsmiR-21

3 討論

缺血性心肌病隨著發病率逐年上升，如何有效防治一直是研究的熱點，中醫藥對本病的防治有一定優勢。加味丹參飲是湖南省名中醫黃政德治療缺血性心肌病的經驗方，由清代陳念祖《時方歌括》中的丹參飲化裁而來。臨床觀察結果表明，加味丹參飲對冠心病心絞痛療效顯著，可以迅速緩解心前區疼痛的癥狀[9]。實驗表明加味丹參飲對IRI大鼠心肌有明顯的延遲保護作用[10]；其含藥血清可通過增強細胞自噬對IRI心肌細胞發揮保護作用[11-12]。

MicroRNA廣泛參與了體內多種生理、病理過程，可影響各類心血管疾病的發生、發展，如心肌肥大、心肌纖維化、心肌梗死等[13]。miR-21 在心血管系統中高度表達，若其過表達可減輕缺血缺氧所導致的心肌細胞凋亡和損傷，是緩解心肌損傷以及治療缺血性心臟病等心血管疾病的重要干預靶點[14]。本研究即是探討加味丹參飲結合miR-21在調控PTEN/Akt信號通路對大鼠心肌細胞的影響。

本研究結果表明，通過轉染過表達miR-21，可以抑制心肌細胞的凋亡，減輕細胞線粒體的損傷，對心肌有保護作用。其機制通過Western blot 分析發現，IRI組PTEN表達升高，P-Akt表達減少。早期的研究結果表明[15]，激活PI3K/Akt信號通路對缺血性心肌細胞有保護作用，可以抑制心肌細胞的凋亡。miR-21是PTEN的調控基因，當miR-21升高時，PTEN降低，可以激活PI3K/Akt信號通路保護心肌細胞。因此，相對于模型組，在miR-21組中線粒體損傷程度減輕，心肌細胞損傷指標cTnI漏出減少，PTEN降低，P-Akt表達增多，心肌細胞凋亡有所減輕，而在miR-21過表達且加入了加味丹參飲含藥血清干預時，電鏡觀察可見細胞空泡化明顯減少，PTEN進一步降低，P-Akt表達顯著升高，心肌細胞凋亡減輕更為明顯。

綜上所述，外源性miR-21與加味丹參飲聯用時，可以有效保護IRI心肌細胞，其機制可以是通過抑制PTEN表達從而激活PI3K/Akt信號通路有關。然而，若要將治療性MicroRNA快速轉運至患者心肌細胞，藥物遞送方式會受到很多因素的限制，目前尚不能在臨床治療中廣泛應用。因此，探索如何將MicroRNA運送至患者心肌細胞，發揮保護心肌的作用，是防治缺血性心肌病的新思路。