抗抑郁藥蒲郁膠囊對雄性大鼠性功能的影響及其機制初探

賈 銣，邵巖飛，蔣文翔，陳喆鳴，鄭嘉文，蘇詩政，王玉露

(福建中醫藥大學 1.藥學院、2.中西醫結合學院、3. 康復醫學院，福建 福州 350122)

隨著生活節奏的加快和社會競爭的加劇，人們的心理壓力逐漸加大，抑郁癥患病人數逐年增加 ，困擾了人們的生活[1]。抗抑郁藥特別是治療快速、療效好、安全性高的抗抑郁藥逐漸成了社會上新的研究話題。傳統的抗抑郁藥除了對肝臟、神經系統會的損害，還有報道表明各類抗抑郁藥如五羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)、單胺氧化酶抑制劑(monoamine oxidase inhibitors，MAOIs)和去甲腎上腺素(NA)再攝取抑制劑(serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs)以及一些新型的抗抑郁藥都會不同程度地造成性功能障礙[2-3]。許多臨床研究也報道了抗抑郁藥導致性功能障礙的不良反應，尤其是服用含有五羥色胺能特性的抗抑郁藥患者出現性功能障礙的可能性更大。而SSRIs是目前臨床較常用的一類抗抑郁藥，它所引起的性功能障礙也是其比較公認的不良反應[4]。目前，氟西汀已作為動物實驗中雄性大鼠性功能障礙的造模藥物。有臨床研究證實，SSRIs類抗抑郁藥引起性功能障礙的不良反應的原因不僅有中樞作用，還有外周作用[5]。而其具體作用機制還不是非常清楚。

由于西藥抗抑郁藥不良反應較多，人們開始從傳統的植物或藥方中尋找有效治療抑郁的植物或藥物[6]。中醫藥是我國從古至今的瑰寶，在治療抑郁方面有著豐富的經驗，且相比于西藥抗抑郁藥，有著較少的不良反應。蒲郁膠囊是由五味子、酸棗仁、柴胡、郁金、牡蠣等11味藥物組成的中成藥，臨床上常用于治療抑郁癥、神經衰弱、焦慮癥及更年期綜合征等，療效顯著。課題組前期研究也證實蒲郁膠囊在小鼠強迫游泳、懸尾和慢性應激抑郁模型上具有明顯的抗抑郁作用(發表中)，并且在利血平誘導的抑郁模型、育亨賓毒性實驗中顯示出明顯的作用(說明藥物可以增強NA的作用)，對小鼠5-HT增強實驗結果無影響，初步認為其抗抑郁機制與5-HT無關[7]，但其具體作用靶點和副作用仍然不明。本實驗采用交配行為實驗和非接觸性陰莖勃起實驗評價蒲郁膠囊對雄性大鼠性功能的影響，并與米氮平和SSRIs類抗抑郁藥氟西汀進行比較，同時加入5-HT1A受體拮抗劑WAY100635和5-HT1A受體部分激動劑丁螺環酮，觀察其對大鼠性功能的影響是否與5-HT有關，旨在發掘蒲郁膠囊的抗抑郁的作用特點和和機制。

1 材料

1.1 動物SPF級Wistar大鼠，♂和♀各60只，體質量(150±20)g。統一采購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

1.2 藥品蒲郁膠囊(四川諾迪康威光制藥有限公司，溶劑：蒸餾水，0.47 g/粒，批號：150705)；氟西汀(常州第四制藥廠，溶劑：蒸餾水，20 mg/片，批號：201511162)；米氮平(華裕(無錫)制藥有限公司，溶劑：蒸餾水，30 mg/片，批號：16110105)；苯甲酸雌二醇(寧波第二激素廠，溶劑：花生油，2 g·L-1，批號：161210)；黃體酮(浙江仙琚制藥股份有限公司，溶劑：花生油，批號：160205，20 g·L-1)；WAY100635(CAS Number: 634908-75-1，Sigma-Aldrich)；丁螺環酮(CAS Number：33386-08-2，Sigma-Aldrich)大鼠雄激素試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，批號：1703263)。

1.3 儀器超低溫冰箱(美國Eppendorf公司)、微型冷凍離心機(美國Eppendorf公司)、大鼠透明觀察籠(PC-R4)(中國豐碩動物實驗器材)、金屬絲籠(自制)、連續波長多功能酶標儀(奧地利TECAN公司)、微量震蕩儀(東南科儀有限公司)。

2 方法

2.1 ♀發情大鼠的制備

2.1.1卵巢摘除術 將♀大鼠用300 mg·kg-1水合氯醛麻醉后固定，在大鼠最末肋骨下(離尾椎約7～8 cm距離)，沿中線和距脊柱外側去皮毛，碘伏局部消毒，自腰椎沿背部正中線向下，切開皮膚，于左右兩肋剪開腰肌。分離脂肪，可見位于兩側腎臟外下方呈粉紅色的卵巢，結扎卵巢下輸卵管及脂肪，剪下卵巢，確定無出血后，將子宮角送回腹腔，縫合，傷口涂碘伏,如Fig 1。術后連續3日每只雌鼠每日肌注青霉素4 萬U，術后休息兩周。將60只摘除卵巢的大鼠，隨機分為12籠飼養，每籠5只。每天均正常喂養食物和水。

2.1.2♀交配實驗前準備 每只雌鼠測試52 h之前皮下注射0.002 mg·L-1苯甲酸雌二醇30 μg，4～6 h前皮下注射0.01 mg·L-1黃體酮500 μg，促進雌鼠發情，苯甲酸雌二醇和黃體酮注射液用玉米油稀釋水浴加熱1 h混勻后備用。

Fig 1 Preparation of female estrus rats

2.2 ♂大鼠篩選和給藥程序

2.2.1♂大鼠的篩選 參照文獻并稍做修改，實驗于下午4 ∶00開始進行，室內環境為安靜，暗光觀察，將雄鼠放入40 cm×60 cm×40 cm大鼠透明觀察籠中適應5 min后再放入發情雌鼠，觀察交配行為，30 min/次，在30 min內如果出現1次插入行為即可停止實驗，一周2～3次，進行4次訓練，♂大鼠在后3次(或共3次)均有插入行為的大鼠入選。

2.2.2給藥程序 正常喂養4周后，將♂大鼠按體質量隨機分為6組，分別為空白對照組(Control，Con)，氟西汀10 mg·kg-1組(Fluoxetine，Flx)，米氮平2 mg·kg-1組(Mirtazapine，Mirta)，蒲郁膠囊(PuYu capsule)的235、470、940 mg·kg-13個劑量組(分別是臨床等效劑量的0.5、1、2倍，參考藥理學實驗教材中的換算公式進行換算得出)，各組溶劑均用蒸餾水稀釋。灌胃給藥時間為每天早晨9點，每天1次，連續給藥23 d，在d 6和d 13進行交配行為實驗，d 7和d 14進行非接觸性陰莖勃起實驗，在d 19、20和d 23、24急性給予5-HT1A受體拮抗劑WAY100635(0.3 mg·kg-1, 腹腔注射)[8]和5-HT1A受體部分激動劑丁螺環酮(buspirone，15 mg·kg-1, 腹腔注射)[9]拮抗劑后觀察交配行為實驗和非接觸性陰莖勃起實驗。繼續重復給予氟西汀、米氮平和蒲郁膠囊1周后，處死大鼠，取材備用。如Fig 2。

Fig 2 Procedure of drug administration

2.3 交配行為實驗[10]實驗于下午4 ∶00開始進行，室內環境為安靜，暗光觀察,將雄鼠放入40 cm×60 cm×40 cm 大鼠透明觀察籠中適應5 min后再放入發情雌鼠，觀察交配行為，30 min/次，測試指標如下，1)爬垮次數Nm(number of mounts);2)射精次數Ne(number of ejaculations，射精指標：插入后停留1～3 s，規律的收縮，之后雌鼠離開雄鼠，雄鼠舔舐生殖器);3)爬垮潛伏期Ml(mount latency，從放入雌鼠到第1次撲捉的時間);4)射精間歇時間Pi(post ejaculatory interval，從射精到下一次交配的時間);5)插入次數Ni(number of intromissions，事后舔舐生殖器);6)插入潛伏期Il(intromission latency，從放入雌鼠到第一次插入的時間)。

2.4 非接觸性陰莖勃起實驗[10]實驗于下午4 ∶00 開始，將發情雌鼠提前30 min單獨放于金屬絲籠(40 cm×25 cm×18 cm)中，將雄鼠單獨放于另一金屬絲籠(40 cm×25 cm×18 cm)中，緊貼雌鼠籠適應5 min后，觀察30 min。室內環境為安靜暗光，記錄雄鼠陰莖勃起次數Pe(penile erections)。

2.5 取材實驗于早上9點開始，將雄鼠斷頭取血，取出的血液用離心機將血清和血漿分離，將血清吸出放于新的EP管中，轉移至-80 ℃冰箱備用。

2.6 ELISA法檢測♂大鼠血清雄激素水平① 取空白組、米氮平組、氟西汀組、蒲郁膠囊高、中、低組血清做100 倍稀釋(1 μL血清，加標本稀釋液99 μL，稀釋100 倍)；②每孔加入標準品或待測樣品100 μL于96孔酶標板上，混勻后恒溫箱37 ℃ 40 min；③洗滌 4～6 次，濾紙上印干；④每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL(空白除外)，混勻后37 ℃ 20 min，再次洗板；⑤每孔加酶標抗體工作液100 μL，置 37 ℃ 10 min，再次洗板；⑥每孔加入底物工作液100 μL，37 ℃暗處15 min；⑦每孔加入100 μL終止液混勻，于30 min內在450 nm處用酶標儀檢測吸光值。

2.7 統計學分析本實驗統計學分析采用GraphPad Prism 7.0 統計軟件，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA，post hoc test 選用Dunnett’t檢驗)。

3 結果

3.1 蒲郁膠囊重復灌胃給藥(d 6)對♂大鼠交配行為的影響在交配實驗中，與對照組比較，氟西汀(10 mg·kg-1)灌胃給藥6 d延長雄鼠Ml、Il和Pi，并且Nm、Ni和Ne表現出明顯縮短的趨勢，而蒲郁膠囊(235～940 mg·kg-1)和米氮平(2 mg·kg-1)對♂大鼠交配行為均無影響(見Fig 3)。

Fig 3 Effects of administration (d 6) of PuYu capsule on mating behavior of male rats n=10)

A：Ml, Il, Pi; B：Nm, Ni, Ne.**P<0.01vscontrol

3.2 蒲郁膠囊重復灌胃給藥(d 13)對♂大鼠交配行為的影響♂大鼠灌胃給藥13 d后，與空白組比較，氟西汀組大鼠不僅延長Ml、Il和Pi，而且減少Nm、Ni和Ne。而蒲郁膠囊和米氮平對♂大鼠交配行為均無影響。見Fig 4。

3.3 蒲郁膠囊重復灌胃給藥(d 7、d 14)對♂大鼠非接觸性Pe的影響♂大鼠灌胃給藥7 d后，與空白組比較，氟西汀會減少♂大鼠非接觸性Pe，蒲郁膠囊和米氮平對大鼠Pe改變沒有顯著性差異。灌胃給藥14 d后，與空白組比較，氟西汀會減少♂大鼠非接觸性陰莖勃起次數，蒲郁膠囊和米氮平對其Pe沒有顯著性差異(見Fig 5)。

3.4 蒲郁膠囊重復灌胃給藥(d 19)后單次給予WAY100635拮抗后對♂大鼠交配行為的影響♂大鼠灌胃給藥19 d后，急性給予WAY100635，與對照組比較，氟西汀、米氮平、蒲郁膠囊對雄鼠Ml、Il、Pi、Nm、Ni、Ne均無影響，提示WAY100635可以逆轉氟西汀引起的性功能障礙,同時對蒲郁膠囊無影響(見Fig 6)。

Fig 4 Effects of administration (d 13) of PuYu capsule on mating behavior of male rats n=10)

A：Ml, Il, Pi; B：Nm, Ni, Ne.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 5 Effects of administration (d 7, d 14) of PuYu capsule on penile erections of male n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.5 蒲郁膠囊重復灌胃給藥(d 23)后單次給予丁螺環酮拮抗后對♂大鼠交配行為的影響♂大鼠灌胃給藥23 d后，急性給予丁螺環酮，與對照組比較，氟西汀、米氮平、蒲郁膠囊對雄鼠Ml、Il、Pi、Nm、Ni、Ne均無影響，提示丁螺環酮可以逆轉氟西汀引起的性功能障礙，同時對蒲郁膠囊無影響(見Fig 7)。

Fig 6 Effects of administration (d 19) of PuYu capsule and WAY100635 on mating behavior of male rats n=10)

A：Ml, Il, Pi; B：Nm, Ni, Ne.

3.6 蒲郁膠囊重復給藥后單次給予WAY100635(d 20)和丁螺環酮(d 24)對♂大鼠非接觸性陰莖勃起實驗Pe的影響♂大鼠灌胃給藥20 d和24 d后，急性給予WAY100635和丁螺環酮，與對照組比較，氟西汀、米氮平、蒲郁膠囊對雄鼠勃起次數均無影響(見Fig 8)。

3.7 蒲郁膠囊對雄鼠雄激素的影響如Tab 1所示，取雄鼠血清做試劑盒后，與空白組比較，氟西汀、米氮平和蒲郁膠囊組都沒有明顯變化。

Tab 1 Effects of PuYu capsule, fluoxetine and mirtazapine on androgen of male rats

4 討論

由于SSIRs類抗抑郁藥對性功能的影響，越來越多學者開始關注抗抑郁藥引起性功能障礙的原因，Hueletl-Soto等[10]在大鼠實驗中證實了慢性給予氟西汀對大鼠造成的性功能障礙，而Sukoff Rizzo等[8]通過動物實驗發現5-HT1A受體阻斷藥可逆轉氟西汀引起的性功能障礙。Schijven等[11]發現五羥色胺能系統異常的弗林德敏感系(FSL)大鼠與弗林德抗性株系(FRL)大鼠相比射精率更高，可能是由于FSL大鼠5-HT1A受體密度較低的緣故，進一步推測引起性功能障礙的主要作用靶點可能是突觸后膜的5-HT1A受體。

Fig 7 Effects of administration (d 23) with PuYu capsule and buspirone on mating behavior of male rats n=10)

A：Ml, Il, Pi; B：Nm, Ni, Ne

Fig 8 Effects of 20 d or 24 d administration with PuYu capsule and WAY100635 or buspirone on penile erections of male rats n=10)

本實驗采用大鼠交配行為實驗和非接觸性陰莖勃起實驗來檢測藥物對♂大鼠性功能的影響。首先重復給予蒲郁膠囊、氟西汀和米氮平1周和2周后分別觀察大鼠性功能的變化，發現氟西汀重復給藥1周即可導致大鼠性功能障礙，蒲郁膠囊和米氮平無此不良反應；重復給藥2周后，結果與1周的結果一致。說明氟西汀重復給藥能引起大鼠性功能障礙，與其他研究結果一致，同時可以證實蒲郁膠囊重復給藥對大鼠性功能無影響。

為了進一步驗證性功能障礙的發生機制與5-HT的關系，在重復給藥后分別急性給予5-HT1A受體拮抗劑WAY100635和部分激動劑(部分激動劑的特點為單用有較弱的激動作用，與激動藥合用時為拮抗作用)丁螺環酮可以逆轉氟西汀的性功能障礙作用，這與其臨床療效是一致的。同時WAY100635和丁螺環酮對蒲郁膠囊無影響，說明氟西汀引起性功能障礙的可能靶點在5-HT1A受體，而蒲郁膠囊的抗抑郁作用與5-HT1A受體無關。

在選擇氟西汀的同時，我們還選擇了米氮平作為對照藥物，米氮平[12]被分類為去甲腎上腺素和特異性5-羥色胺能抗抑郁藥，作為腎上腺素α2受體的拮抗劑，其功能主要是抑制自受體和異受體，提高去甲腎上腺素和5-羥色胺能的神經傳遞，但是并沒有性功能障礙的副作用[13]。有研究認為，米氮平的突觸后5-HT拮抗作用與其突觸前α2-腎上腺素受體阻斷相結合是逆轉SSRIs誘導的性功能障礙的作用機制[14]。米氮平不具有5-羥色胺能活性，不會引起5-羥色胺能副作用或5-羥色胺綜合征，這與其不是5-羥色胺再攝取抑制劑或單胺氧化酶抑制劑，也不是5-羥色胺受體激動劑的事實一致。在米氮平的臨床研究中發現它可以上調重度抑郁癥患者前額皮層的5-HT2A受體的表達[15]。以上研究都說明米氮平的抗抑郁作用與5-HT1A受體無關。進一步證實抗抑郁藥引起的性功能障礙可能與5-HT1A受體有關。但米氮平會導致嗜睡、過度鎮靜、口干、食欲和體重增加等不良反應，嚴重影響患者的正常生活，并不是一個理想的抗抑郁藥物。

因為測試對象為♂大鼠，我們在行為學結束后繼續給藥1周后取血，通過大鼠雄激素試劑盒檢測受試雄鼠的性行為變化是否與雄激素的變化有關，結果顯示蒲郁膠囊、氟西汀和米氮平對雄激素沒有影響，說明氟西汀對性功能的影響不是通過影響雄激素而引起的。

本實驗研究對象蒲郁膠囊的主要成分郁金，味苦，性寒，具有解郁、涼血之功；石昌蒲，味苦，性溫，具有開竅、豁痰之力，再配以具有柴胡等疏肝解郁的10余種中藥，從而有疏肝解郁、清心化痰的功效。臨床應用上，蒲郁膠囊對抑郁癥有良好的治療作用，且不良反應較少。本課題的前期研究也表明蒲郁膠囊在懸尾、強迫游泳抑郁小鼠模型和慢性不可預知抑郁小鼠模型上都有明顯的抗抑郁作用。通過本實驗的研究可以看出蒲郁膠囊對性功能的影響優于氟西汀等五羥色胺再攝取抑制劑，體現了中藥治療抑郁癥的臨床優勢；同時，在前期機制研究中發現蒲郁膠囊對5-HT作用不敏感，與本實驗結果一致，提示蒲郁膠囊的抗抑郁機制與5-HT無關，其具體作用靶點還需進一步研究證實。

總之，抗抑郁西藥如氟西汀等在治療抑郁癥時，雖然療效明顯，但其不良反應繁多，在治療的同時又使患者承受其他痛苦，長期的服用還會對腸胃和肝臟造成一定的損害，并且不能預防抑郁癥的復發。中醫藥治療抑郁癥有辨證施治、專方專藥等諸多方法，但在診斷和療效標準、證型規范等方面依舊存在問題，所以需要我們不斷的對中藥藥理作用和機制進行深度研究和反復驗證，為中藥新藥的開發奠定基礎。

(致謝：本研究在福建中醫藥大學中藥藥理毒理實驗室王玉露課題組完成，研究工作得到該實驗室諸多同仁的幫助，特此致謝！)