運動神經元生存蛋白缺失與心臟疾病的研究進展

鐘 曉 宋紫光 高萍萍 宋 湘

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是一種常染色體隱性遺傳疾病，在新生兒中的發生率約為1/6000[1]。運動神經元生存基因1(survival of motor neuron 1,SMN1)突變引起運動神經元生存蛋白(survival of motor neuron, SMN)水平降低,繼而導致SMA的發生。雖然SMN蛋白普遍表達于各種細胞內，但在SMA疾病中主要表現為腦干和脊髓中α運動神經元的退化。進行性神經元退化使延髓受損、軀干和四肢肌肉無力，在疾病的終末階段可以導致患者癱瘓、呼吸衰竭，最終死亡[2]。

SMA傳統上被認為是神經肌肉疾病，但越來越多的證據表明它是一種多系統疾病。據報道，在SMA患者和小鼠模型中外周組織和細胞均有受到影響，包括肝臟、肺、胰腺、脾臟、睪丸、腸和心血管系統的異常[3]。

SMA患者存在心臟異常在60多年前已經被提出，但直到現在心臟異常是SMA的一個潛在的核心病變這一觀點才被接受，尤其是在嚴重的疾病中[4]。為了更詳細地研究SMN蛋白與心臟異常的關系，筆者對現有的臨床和實驗文獻做一綜述。

一、SMN蛋白的結構、分布和功能

SMN蛋白主要由位于5號染色體長臂1區3帶(5q13)上的SMN1基因表達產生[5]。SMN蛋白由294個氨基酸組成，相對分子質量為38kDa，在所有細胞類型的細胞質和細胞核中普遍表達，并且可以和許多蛋白質與RNA相互作用[4]。

目前已經清楚SMN蛋白參與了許多細胞通路，但SMN蛋白第1個確定的和研究最多的功能是其在小核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNP)組裝中的作用。SMN蛋白參與了snRNP的生成以及其向細胞核轉移的過程[6]。 snRNP與一些額外的蛋白質一起形成大型顆粒狀復合物,稱為剪接體。剪接體是一個復雜的機器，它催化移除前體mRNA中的內含子[7]。對SMA患者或小鼠模型細胞剪接活性的研究揭示了SMN蛋白在 snRNP組裝中的基本作用，以及snRNP水平降低與疾病嚴重程度之間的相關性[6]。

SMN蛋白在神經生長、軸突及突觸細胞骨架的形成過程中起著重要的作用，并且參與高爾基體相關分泌囊泡轉運[8]。SMN蛋白還可以通過多種機制調控蛋白質翻譯。如改變mRNA亞細胞定位，通過與核糖體自身的聯系調節核糖體單位的局部翻譯，通過調控mTOR通路來影響蛋白質的表達。研究表明，SMN蛋白在其他領域也具有重要功能，如影響細胞骨架動力學、內吞作用,參與蛋白質周轉過程的自噬、泛素蛋白酶體途徑和線粒體活動的監管[6]。

二、SMN蛋白缺失導致的心臟異常改變

1.SMN蛋白缺乏導致SMA患者心臟異常:2017年一項綜述納入72篇發表的文章，包括264例心臟異常的SMA患者。SMA患者中主要表現為心律失常和結構性心臟改變。77例SMA 1型患者中有33例患者出現心電圖異常，15例患者心電圖顯示有嚴重癥狀的心動過緩，即心率低于40次/分，其他18例患者出現基線震顫。77例SMA 1型患者中有42例SMA 1型患者存在結構性心臟缺陷，其中50%存在單一的心臟結構異常，包括房間隔缺損、室間隔缺損和左心發育不良綜合征。其余患者存在多處結構性心臟異常[4]。

63例SMA 2型患者有心電圖基線震顫。少數患者還有一個或多個心電圖異常，包括沖動發生異常的竇性心動過速，沖動傳導異常的右束支傳導阻滯，以及心房擴大、心室擴大、心室肥大和心肌損害[4]。124例SMA 3型患者中有67例僅有心電圖基線震顫。6例患者同時出現心電圖異常和結構性心臟病，如QT間期延長、二尖瓣和三尖瓣脫垂、室間隔肥厚、心室后壁肥厚或萎縮、左心室舒張末期容量減少等異常改變[4]。

從上述研究可以發現結構性心臟病幾乎只在SMA 1型患者中發生，而獲得性心臟病理學，包括心律失常和傳導異常，在受影響較輕的患者中報告更頻繁,即SMN蛋白水平越低心臟異常表現越嚴重。Rudnik-Schoneborn等[9]研究支持了SMN蛋白在心臟發育中的關鍵作用。事實上，他們發現在單拷貝SMN2的患者中(產生SMN蛋白水平較少)，先天性間隔缺損的發生率接近75%。而在無SMA的患者中，其發生率接近1/5000萬。心房撲動和心房顫動在50歲以下的年輕人中發生率特別低，但在SMA患者中普遍發生于年輕時期，這也揭示了SMN蛋白在心臟異常發生中的重要作用[4]。

2.SMN蛋白缺乏導致小鼠心臟異常：在輕度和重度SMA小鼠模型中，SMN蛋白缺乏也造成了心血管的異常。包括以室間隔和左心室壁變薄為代表的結構變化、擴張型心肌病、纖維化和氧化應激增加，但先天性心臟病如房室間隔缺損的發病卻很少[10]。在輕度和重度的小鼠模型中，射血分數下降和心律失常，特別是心動過緩的報道都表明了心功能的改變[11,12]。值得注意的是，在非常溫和的Burgheron小鼠模型中，一些小鼠死于嚴重的心肌病，而不是神經肌肉病理學的影響[12]。

Bevan等[11]研究發現SMN蛋白缺乏會導致小鼠早期和持續性的心功能障礙。出生后14天，重型SMN△7小鼠和正常野生小鼠對照，超聲心動圖顯示心臟大小、左心室質量均下降，室壁厚度變薄、左心室短軸縮短率下降、心動過緩。隨著疾病的發展，逐漸發展為心肌收縮力下降的擴張型心肌病。

Wijngaarde等[4]總結了14項研究，記錄了SMA小鼠模型心臟病理學的改變。常見的宏觀表現包括心臟尺寸減小、左心室壁和室間隔厚度減少。而顯微鏡觀察最常見的是心臟纖維化，中等及嚴重SMA小鼠模型中在疾病的癥狀前階段就可以檢測到。此外，幾乎所有對SMA小鼠模型的研究都報道了慢速心律失常[4]。最近一項SMA嚴重小鼠模型的研究證實了此前的許多研究結果，但也注意到心臟中血液的顯著匯集，以及心肌細胞的解體和肌小梁的缺失[13]。可見SMN蛋白的缺乏也會導致小鼠心臟異常改變。

三、SMN蛋白降低導致心臟異常改變可能的機制

SMN蛋白的降低是如何導致心臟機械和電生理改變，相關的研究較少，但目前的幾項研究可以提供一定的參考。

1.SMN蛋白的減少導致線粒體功能障礙：Maxwell等[13]在SMA小鼠出生早期發現線粒體源性氧化應激增加，尤其是與SMN蛋白直接作用的ATP合成復合物亞基6(該物質參與氧化應激反應)表達增加。心肌細胞含有許多線粒體以支持其高能量需求，因此對線粒體功能障礙介導的氧化應激非常敏感。出生時氧化應激增加不僅表明這是SMA心臟病理學病因中的一個重要事件，而且還表明早期線粒體功能障礙。Bevan等[11]對出生晚期的SMNΔ7小鼠心臟進行分析，發現心肌細胞的超微結構發生了顯著變化，肌細胞的肌質幾乎充滿了線粒體。許多線粒體表現出退行性改變，如嵴碎裂，伴有相關的空泡變性，這與晚期心力衰竭一致。衰竭的SMA心肌線粒體大小的增加可能是由于能量需求增加所進行的代償。也可能是由于不適應導致氧化細胞色素的釋放，和(或)線粒體通透性轉變的開始，兩者對心泵功能都有害[14]。以上研究均表明線粒體功能障礙可能是SMA心臟缺陷的主要驅動因素，SMN蛋白的缺乏影響線粒體的形態和功能改變。

2.SMN蛋白的減少影響心肌細胞的凋亡：為了建立SMA心臟結構變化的細胞基礎，Maxwell等[13]對從出生(P1)到癥狀早期(P5)的心肌細胞進行了專門的研究。SMA心臟在癥狀前(P3)和早期(P5)心肌細胞密度顯著減少，但在出生時沒有。為了確定心肌細胞密度下降的本質，他們對細胞增凋亡進行了分析。用Western blot法對caspase-3進行凋亡分析，因為caspase-3參與了caspases的激活級聯反應，也參與了凋亡的發生[15]。在癥狀早期性SMA小鼠心臟中，caspase-3顯著增加。同時在SMA小鼠模型上發現氧化應激的增加導致了細胞進一步的凋亡[13]。這表明心肌細胞密度的降低可能與細胞凋亡的增加有關，而細胞凋亡與心臟萎縮是一致的。

Sheng等[16]通過TUNEL染色和透射電鏡分析超微結構，發現細胞凋亡發生在相對較晚的時間點，細胞凋亡增強存在于組織中，并導致了心臟缺陷。他們還檢測了腫瘤抑制蛋白TRP53/P53(一種SMN相互作用蛋白)的下游基因，包括CDKN1a/p21、Pmaip1/Noxa、Bbc3/Puma、Fas和Bax，發現它們在P4時顯著上調。這些凋亡相關基因的上調可以解釋為什么SMA小鼠心臟組織的凋亡增強,SMN蛋白的減少可引起凋亡級聯反應的發生。

3.SMN蛋白的減少導致心肌纖維化增加：心肌纖維化是心肌細胞外基質過度沉積的結果。它導致組織僵硬和心律失常，并使心力衰竭患者易發生心源性猝死[17]。Shababi等[1]報道，SMNΔ7小鼠心臟間質纖維化，最初在P2上發展，在P5和P9上增強。高水平的纖維化與諸如心率減慢等心臟缺陷相關，提示心肌纖維化是SMA小鼠心臟病理學的重要因素。Shababi等[1]進一步發現SMA小鼠新生心臟組織中存在高水平的活性氧，因此提出氧化應激，一種已知的促纖維化因子，是心臟纖維化的潛在機制。Sheng等[16]觀察到生存蛋白survivin在出生時表達下調，生存蛋白survivin的失調和氧化應激都可能導致SMA小鼠心臟間質纖維化。所以，SMN蛋白減少可以通過增加活性氧和影響下游蛋白導致心肌纖維化。

4.SMN蛋白降低影響下游蛋白表達進一步導致心臟病理性改變：許多微陣列的研究，觀察到廣泛的基因表達缺陷存在于SMA小鼠模型中，包括前mRNA剪接。然而，在脊髓和心臟等受影響組織中，作用于SMN下游的關鍵基因仍不清楚。最近，Sheng等[16]確認Birc5(survivin)是SMA心臟發病的關鍵基因。存活蛋白survivin作為凋亡抑制因子家族中最小的成員，在有絲分裂細胞中起著關鍵作用。最重要的是，survivin決定了心肌細胞總數，是出生后心臟發育必不可少的。他們用特異性siRNA抑制正常小鼠原代心肌細胞SMN基因表達，發現存活蛋白survivin表達降低，并引起細胞周期停滯，表明存活蛋白survivin是SMN的下游。單獨過表達存活蛋白survivin可以顯著恢復細胞周期進展，表明SMN蛋白缺乏在SMA心肌細胞的細胞停滯中的關鍵作用。而且，只要survivin的表達得以恢復，其他基因的失調可在一定程度上得到耐受。因此，作為SMN下游蛋白，survivin是導致SMA心力衰竭的主要因素之一。

有研究者對SMN下游蛋白進行蛋白組學分析，發現在嚴重脊髓性肌萎縮的小鼠模型中，核纖層蛋白A/C失調導致心臟病理改變。核纖層蛋白A和C，由LMNA基因編碼，除了為細胞核提供結構支持外，還涉及其他幾種功能，包括機械信號、染色質組織和基因表達調控。LMNA基因突變引起的疾病主要表現為心臟病理改變。每個患者患有嚴重的心臟疾病，最終需要起搏器治療。在每個病例中進行家族史檢查，顯示出高頻率的心臟異常和突然無法解釋的心臟病死亡[18]。這使得核纖層蛋白A/C的正確功能成為維持心臟健康的關鍵要求。他們發現，在SMA小鼠模型的心臟組織中，核纖層蛋白A/C強有力地增加，因此表明核纖層蛋白A/C至少部分負責先前報道的SMA中的心臟缺陷。SMN蛋白水平降低，似乎很可能增加的核纖層蛋白A/C水平使心肌細胞變硬，阻礙其正常收縮的能力并誘導先前在SMA中報道的心臟缺陷。

對于SMN蛋白的缺陷如何導致心臟異常，還有其他一些可能的解釋，包括可能干擾正常心臟發育的特定mRNA剪接[19]。低水平SMN蛋白已經顯示出影響動物模型中的胚胎器官發育，包括心臟發生[2]。低水平的SMN蛋白也可能導致心臟發生中特定細胞類型的功能障礙。潛在的候選細胞類型是神經嵴細胞(NCC)，心臟神經嵴細胞(cNCC)由NCC遷移并分化而成。這些細胞參與大血管的肌結締組織(中膜)、心臟流出道間隔(將圓錐管分為主動脈和肺干)、心房和心室間隔的發育[4]。SMN蛋白缺乏可能改變下游信號通路的功能，這些通路對于NCC的遷移過程很重要[20]。此外，盡管心臟電傳導系統本身來自心肌細胞，但導致心律失常的心臟自主神經系統發展來自NCC[21]。所以SMN蛋白濃度降低后對心肌細胞和自主神經系統產生雙重影響導致SMA患者及動物模型表現出心臟異常改變。

四、SMN蛋白減少導致心肌損害的治療

目前對于SMA疾病除了支持和對癥治療外，特異性治療很有限。而對于SMN蛋白降低導致的心肌損害的治療，目前只在動物模型上進行初步嘗試。Heier等[22]用曲古抑菌素A(一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑)治療的小鼠可以改善心率和心臟大小，而且神經肌肉功能也得到改善。Bevan等[11]研究了自身互補腺相關病毒9型 (selfcomplementary adeno-associated virus type 9,scAAV9)攜帶SMN基因對SMNΔ7小鼠心臟缺損的治療作用。同樣在產后早期使用scAAV9-SMN治療，可以預防心動過緩和擴張型心肌病的早期發展。Shababi等[23]也使用表達全長SMN cDNA的scAAV9處理SMNΔ7模型，表明SMA心臟存在纖維化、氧化應激激活、血管重塑和毛細血管數量顯著減少。在治療的動物中，心臟結構缺陷得到改善。通過體內心臟磁共振成像的功能分析顯示，經治療的SMA小鼠的心臟仍然表現出功能缺陷。所以在出生后治療的SMA動物中僅部分挽救了心臟功能。Biondi等[24]在SMA小鼠模型中研究了體育鍛煉對心肺功能的影響，并觀察到許多益處，包括減少心肌成熟的延遲、減少纖維化、提高心肌傳導速度和減少心律失常、心肌梗死和心動過緩，恢復部分心臟功能。此外，該研究結果顯示交感神經系統有助于改善該模型中的心律失常和心動過緩。

五、展 望

綜上所述，SMA患者及模型研究表明SMN蛋白在心臟的發生和維持心臟正常功能中具有重要作用，SMN蛋白的缺乏導致了心臟結構、電和機械功能的病理改變。這些發現提供了一個新的研究領域，有利于對遺傳學確診的SMA患者進行可控、標準、統一和全面的心臟檢查。解開SMN相關細胞類型中的分子通路，有助于設計最適合治療的靶點，這些靶點可與SMN靶向治療相結合，有助于提高SMA治療的臨床成功率。