當歸多糖通過調節p38通路抑制宮頸癌Hela細胞生長、遷移和侵襲①

唐治蓉 龍瓊先 劉欣雅 廖文華 張旭乾 王勝嵐 (南充市中心醫院病理科，南充 637000)

宮頸癌也稱子宮頸癌，是常見的發生在子宮陰道部及宮頸管的婦科惡性腫瘤，是繼乳腺癌之后的女性健康第二殺手[1]。目前，每年我國診斷出宮頸癌新發病例將近一百萬，年死亡率高達30%以上，其發病率和死亡率還在急劇上升[2]。宮頸癌主要以手術、化療、放療三大方式治療，治療藥物主要是順鉑等，但這些治療藥物存在毒副作用大、容易讓患者產生耐藥性等缺陷，因此，找到新的宮頸癌治療藥物是迫切需要解決的問題[3]。當歸多糖(angelica polysaccharide，AP)是中藥當歸的主要水溶成分，具有明顯地改善血液系統、免疫促進、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[4]。已有研究證明，當歸多糖能夠抑制宮頸癌Hela細胞的增殖并誘導這些細胞凋亡[5]，但當歸多糖對宮頸癌Hela細胞遷移和侵襲的機制尚不清楚。p38通路參與調節細胞的生長、分化、分裂、死亡等，其以正調節的方式參與了腫瘤的發生、侵襲及轉移[6]。本文主要研究當歸多糖通過p38通路對宮頸癌Hela細胞生長、遷移和侵襲的影響，以期為宮頸癌的治療提供參考數據。

1 材料與方法

1.1材料 4～6周齡，體重18～22 g雌性BALB/c裸鼠50只，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證：SCXK(川)2015-030。宮頸癌Hela購自中國科學院細胞庫，RPMI1640培養液(上海栩冉生物科技有限公司)，胎牛血清(素爾生物科技有限公司)，當歸多糖(西安雨澤生物科技有限公司)，順鉑(浙江聯碩生物科技有限公司)，SB203580(百奧萊博生物科技有限公司)，RIPA裂解緩沖液(南京海克爾生物科技有限公司)，BCA試劑盒(上海易色醫療科技有限公司)，p-p38抗體和p38抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)，MMP-2抗體(上海戶實醫藥科技有限公司)，MMP-9抗體(上海滬崢生物科技有限公司)，二抗(維奧生物科技有限公司)，ECL化學發光底物(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組處理 裸鼠飼養在SPF級動物實驗室，實驗前適應1周。在超凈工作臺內于每只裸鼠右后肢皮下注射0.2 ml(2×107個/L)的宮頸癌Hela細胞懸液，用游標卡尺測量皮下腫瘤體積，7 d后所有裸鼠均出現大于100 mm3的皮下結節，表明移植瘤模型構建成功。將50只造模成功的裸鼠隨機分為5組：模型組、陽性對照組(2 mg/kg順鉑)，低、中、高劑量當歸多糖組(30 mg/kg、100 mg/kg、300 mg/kg)[7]，每組10只，每天腹腔給藥0.2 ml，連續21 d。脫頸法處死所有裸鼠，完整剝離移植瘤，測量移植瘤體積及質量，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-實驗組移植瘤重量/模型組移植瘤重量)×100%。治療期間實驗組裸鼠死亡超過20%(2 只)或平均體質量(去瘤后)下降>15%則認為藥物具有毒性。

1.2.2細胞培養及分組處理 宮頸癌Hela細胞在37℃、5%CO2條件下，于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養。實驗設置宮頸癌Hela組，陽性對照組，當歸多糖低、中、高劑量組，SB203580組，當歸多糖高劑量+SB203580組，其中宮頸癌Hela組細胞用正常培養基培養，陽性對照組細胞用含有10 μmol/L順鉑的培養基培養，當歸多糖低、中、高劑量組細胞分別用含有100、200、400 mg/L 當歸多糖的培養基培養[8]，SB203580組細胞用含有10 μmol/L SB203580的培養基培養，當歸多糖高劑量+SB203580組用含有400 mg/L當歸多糖和10 μmol/L SB203580的培養基培養。

1.2.3MTT檢測細胞生長情況 細胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板，分別用各組培養基制成單細胞懸液，置于 37℃ 5%CO2的條件下培養。每組設5個復孔，待細胞長至 50%融合時，分別于轉染后0、12、24、36、48 h 加入20 μl MTT 溶液，再培養4 h，棄上清后加入150 μl DMSO，于酶標儀490 nm 處檢測OD值。

1.2.4劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將各組宮頸癌Hale細胞消化鋪滿單層后用小號槍頭垂直劃痕，加入無血清培養基，在5%CO2、37℃恒溫的培養箱培養24 h后，分別在顯微鏡下拍照，用 Image J 軟件分析。

1.2.5Transwell檢測細胞侵襲情況 將細胞以無血清培養液培養24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代接種于用Matrigel預處理的Transwell小室中，細胞終濃度為3×105個/ml。小室上層加入無血清培養液培養細胞，下層則加入含血清的各組培養液。48 h后用無菌棉簽擦去小室上層細胞，下層細胞HE染色后計數統計。

1.2.6Western blot檢測p-p38和p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平 用RIPA裂解液提取培養3 d 的各組細胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(p-p38 1∶500、p38 1∶1 000、MMP-2 1∶500、MMP-9 1∶500)于4℃封閉過夜，第二天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴ECL進行曝光。

2 結果

2.1當歸多糖抑制宮頸癌移植瘤的發展 實驗結束時，各組裸鼠均無死亡。與模型組相比，陽性對照組和當歸多糖裸鼠移植瘤重量和體積均明顯減少，抑瘤率明顯增加，均具有統計學意義(P<0.05，P<0.01，圖1)，且當歸多糖各組隨著當歸多糖劑量的增加，抑制效果越明顯，這說明當歸多糖呈劑量依賴性抑制宮頸癌移植瘤的發展。

2.2當歸多糖抑制宮頸癌Hela細胞的生長 通過MTT檢測細胞生長情況可知：與宮頸癌Hela組相比，陽性對照組和當歸多糖各組Hela細胞的生長受到不同程度抑制，均具有統計學意義(P<0.01，圖2)，且當歸多糖各組隨著當歸多糖劑量的增加，抑制效果越明顯，這說明當歸多糖呈劑量依賴性抑制宮頸癌Hela細胞的生長。

2.3當歸多糖抑制宮頸癌Hela細胞的侵襲和遷移 通過劃痕實驗檢測細胞遷移能力發現：與宮頸癌Hela組相比，陽性對照組和當歸多糖各組Hela細胞的遷移能力受到不同程度抑制，劃痕閉合率明顯降低，均具有統計學意義(P<0.01，圖3A)，且當歸多糖各組隨著當歸多糖劑量的增加，抑制效果越明顯，這說明當歸多糖呈劑量依賴性抑制宮頸癌Hela細胞的遷移。

通過Transwell檢測細胞侵襲情況發現：與宮頸癌Hela組相比，陽性對照組和當歸多糖各組Hela細胞的侵襲細胞數目明顯降低，均具有統計學意義(P<0.01，圖3B)，且當歸多糖各組隨著當歸多糖劑量的增加，降低程度越明顯，這說明當歸多糖呈劑量依賴性抑制宮頸癌Hela細胞的侵襲。

圖1 當歸多糖抑制宮頸癌移植瘤的發展

圖2 MTT檢測Hela細胞生長情況

2.4當歸多糖抑制宮頸癌Hela細胞p38通路 通過Western blot檢測 p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平可知：與宮頸癌Hela組相比，陽性對照組和當歸多糖各組Hela細胞的p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯下調，均具有統計學意義(P<0.01，圖4)，且當歸多糖各組隨著當歸多糖劑量的增加，下調程度越明顯，這說明當歸多糖呈劑量依賴性抑制宮頸癌Hela細胞的p38通路。

2.5當歸多糖通過調節p38通路抑制宮頸癌Hela細胞的生長、侵襲和遷移 加入p38通路抑制劑SB203580后，通過Western blot檢測p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平發現：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當歸多糖高劑量組細胞p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯下調，且具有統計學意義(P<0.01，圖5)，說明SB203580和當歸多糖都能抑制p38通路下游蛋白p-p38/p38、MMP-2和MMP-9表達；與當歸多糖高劑量組相比，當歸多糖高劑量+ SB203580組細胞p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯下調，且具有統計學意義(P<0.01，圖5)。

圖3 各組Hela細胞遷移和侵襲能力

加入p38通路抑制劑SB203580后，通過MTT檢測細胞生長情況可知：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當歸多糖高劑量組細胞生長情況明顯被抑制，且具有統計學意義(P<0.01，圖6)，說明SB203580和當歸多糖都能抑制宮頸癌Hela細胞生長；與當歸多糖高劑量組相比，當歸多糖高劑量+SB203580組細胞生長情況明顯被抑制，且具有統計學意義(P<0.01，圖6)，說明當歸多糖通過調節p38通路抑制宮頸癌Hela細胞生長。

圖4 Western Blot檢測 p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

圖5 加入p38通路抑制劑后，Western Blot檢測p-p38/p38、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

圖6 加入p38通路抑制劑后，通過MTT檢測細胞生長情況

圖7 加入p38通路抑制劑后，各組細胞遷移和侵襲能力

加入p38通路抑制劑SB203580后，通過劃痕實驗檢測細胞遷移能力發現：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當歸多糖高劑量組細胞遷移速度明顯被抑制，劃痕閉合率明顯降低，且具有統計學意義(P<0.01，圖7A)，說明SB203580和當歸多糖都能抑制宮頸癌Hela細胞遷移；與當歸多糖高劑量組相比，當歸多糖高劑量+ SB203580組細胞遷移速度明顯被抑制，劃痕閉合率明顯降低，且具有統計學意義(P<0.01，圖7A)，說明當歸多糖通過調節p38通路抑制宮頸癌Hela細胞遷移。

加入p38通路抑制劑SB203580后，通過Transwell檢測細胞侵襲情況發現：與宮頸癌Hela組相比，SB203580組和當歸多糖高劑量組侵襲細胞數目明顯減少，且差異具有統計學意義(P<0.01，圖7B)，說明SB203580和當歸多糖都能抑制宮頸癌Hela細胞侵襲；與當歸多糖高劑量組相比，當歸多糖高劑量+ SB203580組侵襲細胞數目明顯減少，且具有統計學意義(P<0.01，圖7B)，說明當歸多糖通過調節p38通路抑制宮頸癌Hela細胞侵襲。

3 討論

宮頸癌是一種嚴重危害婦女健康和生命的生殖系統惡性腫瘤。據統計，全世界宮頸癌死亡約85%是發生在不發達國家或發展中國家，而我國宮頸癌患者已占到全球病例的 28%以上，同時每天大約 5 萬左右的患者死于該病[9]。而宮頸癌的常規治療手段雖具有一定效果，但是存在較多副作用和并發癥。因此，為了更好的治療宮頸癌，急需發現新藥物。當歸是傘形科植物當歸的根，藥性甘、辛、溫，具有活血、補血、潤腸、調經、止痛等功效，是臨床最為常用的藥物，素有“十方九歸”之說[10]。當歸多糖是中藥當歸的主要活性成分之一，具有調經、補血、消炎、抗菌、鎮痛、提高機體免疫及抗腫瘤等藥理作用。已發現當歸多糖對乳腺癌、肝癌、人神經母細胞瘤等腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用[11，12]，因此，當歸多糖有望抑制宮頸癌Hela細胞的生長、遷移和侵襲。本文通過研究發現當歸多糖呈劑量依賴性抑制宮頸癌移植瘤的發展，并抑制宮頸癌Hela細胞的生長、遷移和侵襲。

局部侵襲和遠處遷移是臨床治療宮頸癌的主要限制因素，也是導致癌癥患者治療失敗和死亡的主要原因之一。因此，降低宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力可以增強宮頸癌治療效果。本文研究表明當歸多糖呈劑量依賴性抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力。p38信號通路對宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲等具有重要的調節作用。本文研究發現，當歸多糖能夠降低p38磷酸化水平，說明當歸多糖能夠下調p38通路。已有Li等[13]報道槐耳水提取物通過p38途徑抑制宮頸癌細胞增殖，Wu等[14]發現苦參堿通過下調p38信號通路抑制人宮頸癌細胞的轉移特性，因此，下調p38信號通路有望抑制宮頸癌細胞生長、遷移和侵襲。同苦參堿有效抑制Hela細胞的黏附和侵襲與其通過抑制p38信號通路的活性進一步調節MMP-2和MMP-9的表達有關一樣[15]，本文發現當歸多糖在與p38信號通路抑制劑SB203580聯合應用后，顯著增強了其對MMP-2和MMP-9的蛋白表達的下調作用及對宮頸癌Hela細胞的生長、遷移和侵襲的抑制作用，提示其對宮頸癌Hela細胞生長、遷移和侵襲的抑制作用是通過調節p38信號通路的活性進一步調節MMP-2和MMP-9的表達來實現的。且已有研究表明，p38 MAPK促進腫瘤細胞遷移和侵襲的機制之一是MMPs的上調，激活p38信號通路能夠有效增強下游如MMP-2和MMP-9等多種靶點的表達與活化[16]。而惡性腫瘤的侵襲和轉移過程主要受蛋白水解酶的表達調控，腫瘤細胞浸潤和轉移能力與蛋白酶的產生程度密切相關[17]。基質金屬蛋白酶是腫瘤細胞完成轉移侵襲的主要蛋白酶，其中以MMP-2 和MMP-9研究最多[18]。MMP-2 和MMP-9的表達升高后，宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力明顯增強；MMP-2 和MMP-9的表達受到抑制之后，宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力明顯抑制[19]。

綜上所述，本文研究發現當歸多糖能夠有效抑制宮頸癌Hela細胞的生長、遷移和侵襲，這種抑制作用可能是通過下調p38信號通路活性，進一步抑制MMP-2和MMP-9表達來實現的。這為當歸的開發利用提供參考數據，為宮頸癌的治療奠定基礎，本文后續將研究當歸多糖對宮頸癌作用的分子機制。