圣草次苷調控MPTP誘導的慢性小鼠帕金森疾病和機制研究①

張曉愉 張昆鵬 王建民 趙曉輝 (邢臺市人民醫院神經內科,邢臺 054000)

帕金森(Parkinson′s disease,PD)又稱為震顫麻痹，是一種常見的神經系統變性疾病，多發于老年人[1,2]。PD主要是由于黑質致密部多巴胺能神經元變性、壞死引起，PD患者腦組織病理改變表現為黑質致密部多巴胺能神經元嚴重缺失，現階段尚無徹底治療的方法[3,4]。圣草次苷又稱為圣草枸楷苷，是一種常見的黃銅類中藥，可減輕氧化應激損傷、降血脂，其抗氧化能力強于橙皮苷、柚皮苷等，同時可以降低血脂[5]。本實驗給大鼠注射MPTP制成PD模型，并使用圣草次苷處理，旨在研究圣草次苷對PD疾病的影響，以期了解圣草次苷對PD治療的作用機理，從而為PD的治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級3周齡SD小鼠75只，購自廣東醫學院實驗動物中心，粵監證字 2004A029號，所有小鼠分15個籠子飼養，每個籠子5只。所有小鼠均在本院動物中心實驗室飼養，飼養溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，該實驗經過動物倫理委員會批準同意。

1.1.2藥物與試劑 圣草次苷(產品編號：E52220；CAS：13463-28-0；純度>98%；分子式：C27H32O15，水溶性)購自上海吉至生化科技有限公司；甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶購自百靈威科技有限公司；蘇木素、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)檢測試劑盒均購自上海恒遠生物科技有限公司；Caspase-3抗體(批號：31A1067201806)購自碧云天公司；Caspase-9抗體(貨號：sc-56076；批號：20190401)、Bcl-2抗體(貨號：sc-7382；批號：20190201)、Bax抗體(貨號：sc-7480；批號：20190301)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；誘生型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)ELISA試劑盒購自安徽大千生物；白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA試劑盒購自美國貝克曼庫爾特有限公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(批號：11684817910)購自美國羅氏公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司。

1.1.3儀器 Sysmex-chemix-180 型全自動生化分析儀購自日本 Furuno Electric公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統有限公司；TGL-16M低溫離心機購自濟南來寶醫療器械有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學儀器廠；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統購于以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型 將75只小鼠適應性喂養1周，采用隨機分組法分為：健康對照組(Control)、模型組(MPTP)、圣草次苷低劑量組(Eriocitrin 8 mg/kg)、圣草次苷中劑量組(Eriocitrin 16 mg/kg)、圣草次苷高劑量組(Eriocitrin 32 mg/kg)，每組各15只；將模型組、圣草次苷低劑量組、圣草次苷中劑量組、圣草次苷高劑量組小鼠制成帕金森小鼠模型，制作方法參考趙夢蝶等[6]研究具體操作如下：腹腔注射20 mg/(kg·d)的MPTP溶液，持續一周制成帕金森小鼠模型，完成造模后，腹腔注射啊撲嗎啡 0.5 mg/kg，10～15 min大鼠出現單側旋轉現象，持續記錄30 min，若旋轉圈數平均>7 r/min，即為造模成功。

1.2.2藥物干預 將水溶性圣草次苷溶解于生理鹽水中，按照劑量配置圣草次苷水溶液。圣草次苷低劑量組(80 mg/kg)、圣草次苷中劑量組(16 mg/kg)、圣草次苷高劑量組(32 mg/kg)使用圣草次苷灌胃處理，模型組和空白對照組使用等量的生理鹽水處理。

1.2.3檢測項目

1.2.3.1小鼠行為學實驗 小鼠行為學實驗采用：曠場實驗、懸掛實驗和游泳實驗，三個實驗均在同一天進行。曠場實驗：曠場裝置由黑色方形基座和黑色墻壁組成。將小鼠放置在房間的角落，適應1 min后，使用視頻計算機跟蹤系統記錄小鼠自發活動5 min 運動路程與停留時間。

小鼠完成曠場實驗后休息2 h開始懸掛實驗，將小鼠懸掛在水平尼龍線上，離開地面20 cm，記錄小鼠能用一只爪抓住尼龍繩的時間。

小鼠完成懸掛實驗后休息2 h開始游泳實驗：將小鼠放入水池中，水池大小為30×30×30 cm，水溫為28℃，記錄小鼠游泳力竭開始下沉時間。

1.2.3.2HE染色和TUNEL染色 完成小鼠行為實驗后使用斷頸法處死小鼠，去小鼠腦組織，使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脫水、蘇木精浸泡、鹽酸酒精分化、沖洗、伊紅染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡，分別采用TUNEL 染色和HE染色，最后中性樹膠封片即可。在10×40的倍鏡觀察小鼠腦組織凋亡情況。

1.2.3.3Western blot 檢測蛋白表達水平 使用Western blot 檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白，取小鼠腦組織，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，以β-actin為內參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.2.3.4ELISA檢測 取小鼠腦組織，剪碎并使用胰蛋白酶制成勻漿，嚴格按照酶聯免疫吸附法試劑盒測操作，測定小鼠肝組織中IL-6、TNF-α、iNOS和IL-10含量水平。

2 結果

2.1小鼠行為學實驗檢測結果 由表1小鼠行為學實驗可以看出，相比健康對照組，模型組小鼠曠場移動路程、曠場中心區域活動時間、游泳時間和懸掛時間均顯著降低(P<0.05)；相比模型組，圣草次苷低劑量組曠場移動路程、曠場中心區域活動時間、游泳時間和懸掛時間均無顯著變化(P>0.05)，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組曠場移動路程、曠場中心區域活動時間、游泳時間和懸掛時間顯著升高(P<0.05)。

2.2染色觀察小鼠神經元凋亡情況 由圖1 HE染色和TUNEL染色可以看出，空白對照組小蘇神經元細胞分布均勻，且基本無壞死；模型組小鼠組神經細胞分布散亂，且數量缺失明顯增多，壞死細胞較多；圣草次苷低劑量組，細胞分布較為散亂，有較多的細胞缺失和壞死；圣草次苷中劑量組神經細胞分布較為整齊，少量神經細胞缺失和壞死。

2.3小鼠腦組織凋亡相關蛋白表達情況 由表2蛋白質印跡實驗可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量組Caspase-3蛋白表達無顯著差異(P>0.05)；相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平顯降低(P<0.05)。

2.4試劑盒檢測小鼠黑質中相關物質含量水平 由表2可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠SOD水平顯著降低，MDA、LDH、GSH水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，圣草次苷低劑量組MDA、SOD、LDH、GSH水平均無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組MDA、LDH、GSH水平顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.05)。

2.5ELISA檢測小鼠外周血相關物質含量水平 由表3 ELISA 檢測結果可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠TNF-α、IL-6、iNOS水平顯著升高(P<0.05)，IL-10無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，圣草次苷低劑量組TNF-α、IL-6、iNOS、IL-10水平均無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組TNF-α、IL-6、iNOS水平顯著降低，IL-10水平顯著升高(P<0.05)。

GroupsnField travel(cm)Activity time(s)Swimming time(s)Hang time(s)Control153 324.56±132.366.13±0.39153.12±10.92123.65±12.32MPTP152 067.31±113.121)3.08±0.451)62.13±9.031)56.52±7.841)Eriocitrin(8 mg/kg)152 106.45±109.673.14±0.2464.06±8.2860.12±8.73Eriocitrin(16 mg/kg)152 698.12±138.542)4.52±0.522)96.54±11.332)84.26±11.172)Eriocitrin(32 mg/kg)152 916.87±126.492)5.77±0.472)123.25±13.022)103.97±14.932)

Note：1)P<0.05，compared with Control group;2)P<0.05，compared with MPTP group.

2.6蛋白質印跡檢測相關信號通路蛋白表達情況 由圖2蛋白質印跡實驗可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

圖1 染色觀察小鼠神經元凋亡情況

GroupsnMDA(mmol/ml)SOD(U/ml)LDH(U/L)GSH(U/ml)Control152.15±0.317.03±0.81789.39±125.0442.05±4.58MPTP155.42±0.541)2.18±0.571)2134.61±284.591)94.27±8.211)Eriocitrin(8 mg/kg)155.28±0.462.54±0.262091.42±234.6291.34±6.73Eriocitrin(16 mg/kg)153.62±0.352)5.14±0.392)1432.39±135.782)65.06±8.192)Eriocitrin(32 mg/kg)152.74±0.522)7.53±0.422)923.48±107.132)53.18±7.522)

Note：1)P<0.05 means comparison with healthy control group;2)P<0.05 means comparison with model group.

GroupsnTNF-α (pg/ml)IL-6(pg/ml)iNOS (pg/ml)IL-10 (pg/ml)Control1545.38±6.5412.39±3.0954.64±8.828.17±1.67MPTP15234.24±25.841)86.27±11.251)201.42±23.481)9.73±1.88Eriocitrin(8 mg/kg)15219.48±19.4284.56±9.34196.43±26.6610.69±2.36Eriocitrin(16 mg/kg)15126.73±16.842)49.81±6.122)125.62±15.282)14.36±2.052)Eriocitrin(32 mg/kg)1579.48±11.922)26.15±5.172)84.32±8.932)22.21±3.532)

Note：1)P<0.05，compared with Control group;2)P<0.05，compared with MPTP group.

圖2 小鼠腦組織凋亡相關蛋白表達情況

圖3 蛋白質印跡檢測相關信號通路蛋白表達情況

3 討論

神經功能評分是衡量PD嚴重程度的重要指標之一，PD患者黑質致密部多巴胺能神經元變性壞死會使得行為受到一定的限制和滯后[7]。本研究發現，相比模型組圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組曠場移動路程、曠場中心區域活動時間、游泳時間和懸掛時間顯著升高，但圣草次苷低劑量組則無顯著變化。說明使用圣草次苷可以有效改善小鼠神經功能，但當劑量低于16 mg/(kg·d)時無顯著效果。

神經細胞的凋亡是為了維持內環境穩定，且受到凋亡相關基因控制，但當神經凋亡過多則會導致神經功能受到影響[8]。caspase家族基因是控制凋亡的重要基因之一，當細胞凋亡途徑激活后，上游信號經傳遞能夠激活下游caspase-9的活化，放大凋亡信號，激活caspase-3，而凋亡信號一旦傳遞到caspase-3蛋白活化，細胞凋亡進入不可逆階段[9,10]。除了caspase家族，Bcl-2家族也是控制細胞凋亡的重要基因之一，主要包括Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞是否凋亡[11-13]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當Bcl-2表達下降時 Bax 表達上升，此時會促進細胞的凋亡；當Bcl-2 表達升高，而 Bax 表達降低時，則會抑制細胞的凋亡。本實驗中可以看出，相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平顯降低，同時可以從HE染色和TUNEL染色實驗看出，使用圣草次苷處理后小鼠腦神經細胞凋亡顯著降低，說明圣草次苷可以降低相關凋亡蛋白的表達，促進抑制凋亡的蛋白表達，實現抑制腦神經細胞的凋亡，保護神經細胞的作用。

炎癥反應時影響PD的重要參數之一，其中TNF-α是一種多功能的調控炎癥因子，其可以通過直接或間接的形式加速脂質對血管的穿透作用，促進脂紋和斑塊的形成[14]；iNOS的高表達，降低血管的收縮能力，會引起腦血管狹窄導致供血不足影響神經細胞功能；IL-10是抑炎癥因子，升高其含量水平可以有效抑制炎癥反應，緩解炎癥帶來的損傷[15]。氧化應激也是加重PD癥狀的重要因素之一?？寡趸w系主要包括酶系和非酶系兩大類，酶系中，最主要的是SOD，其含量多少可以直接反應氧化應激的程度[16]。同時MAD含量增加，并且會使得患者機體的抗氧化能力減弱，導致腦細胞和線粒體膜受損，引起血清丙氨酸轉氨酶升高，同時也會使得腦組織游離脂肪酸水平明顯升高，誘發細胞功能障礙。本研究發現相比模型組，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組TNF-α、IL-6、iNOS、MDA、LDH、GSH水平顯著降低，IL-10、SOD水平顯著升高，圣草次苷低劑量組均無顯著變化。說明使用圣草次苷可以有效降低PD小鼠氧化應激同時降低炎癥反應，但當劑量低于16 mg/(kg·d)時無顯著效果。鮑琛等[17]研究表明：降低氧化應激反應和炎癥反應可以有效治療PD，與本研究得出的結論一致。

Nrf2/HO-1抗氧化反應元件通路是一種可以發揮內源性抗氧化作用來拮抗氧化應激損傷[18]。在PD 患者黑質多巴胺神經元中Nrf2 多數已經核轉位至細胞核內，表達Nrf2可以減輕6-OHDA 對多巴胺神經元損傷保護神經細胞，本研究發現，相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著升高。說明圣草次苷可以激活Nrf2/HO-1通路，促進HO-1、NQO1蛋白表達和多巴胺競爭多巴胺轉運體進入紋狀體-黑質多巴胺能神經元，發生氧化應激反應增強細胞解毒進程和抗氧化能力。趙貝貝等[19]研究表明：激活Nrf2/HO-1可以增強小鼠的抗氧化能力治療PD，與本研究得出的結論相一致。

綜上所述，圣草次苷可以通過抑制氧化應激、炎癥反應，神經細胞的凋亡并激活Nrf2/HO-1信號通路緩解MPTP誘導的慢性PD。但本次實驗所涉及的樣本量較少，在后續實驗中將進一步擴大樣本量進行分析。