番茄紅素抗哮喘作用及機制研究①

金炳熔 車 楠 李良昌 李 莉 (延邊大學醫學院解剖教研室，延吉 133002)

哮喘是一種涉及免疫、環境、遺傳等多種因素的慢性肺部疾病，已成為全球兒童和成人臨床醫學中最常見的疾病之一[1]。哮喘的特點是氣道炎癥，氣道高反應性(airway hyperresponsiveness,AHR)和可逆性氣流阻塞。氣道炎癥通常由免疫細胞過度活化引起，以嗜酸性粒細胞增多、杯狀細胞增生、黏液分泌為特征。氣道炎癥過程中，活化的炎癥細胞分泌細胞毒性介質導致活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生。當機體內ROS水平過高時可誘發氣道氧化應激，無差別損傷細胞內功能生物分子并調控細胞信號的轉導，誘導肥大細胞脫顆粒、氣道重塑和黏液分泌促進氣道損傷，導致哮喘進一步加重[2]。因此，抑制ROS可能是哮喘的潛在治療靶點。番茄紅素(Lycopene,LYC)廣泛存在于自然界的各種水果和植物中，具有免疫調節作用并能夠通過抑制氧化應激在LPS誘導的小鼠肺損傷中發揮抗炎作用[3，4]。目前，番茄紅素對哮喘的作用及機制尚未有明確研究。因此，本研究以卵清蛋白(OVA)建立小鼠哮喘模型，并給予番茄紅素治療，探討番茄紅素對哮喘的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料 番茄紅素、OVA(美國Sigma公司)；活性氧檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(碧云天)；IL-4、IL-5和IL-13 ELISA試劑盒、IL-5(MM550CB)和IL-13(M130B)抗體(美國Invitrogen公司)；IL-4(12227)、p-PI3K(4228)、PI3K(4255)、p-AKT(9275)、AKT(9272)，p-NF-κB p65(3033)、NF-κB p65(6956)和β-actin(4970)抗體(美國Cell Signaling公司)；402型霧化器(四菱醫療器械廠)；氣壓體積描記室(韓國All Medicus公司)；酶標儀(Bio Rad，美國)；流式細胞儀(美國貝克曼公司)；電泳儀及電泳槽(美國Bio Rad公司)；Cytation5多功能成像(美國Bio Tek公司)；Amersham Imager 600凝膠成像系統(美國GE Healthcare)。

1.2方法

1.2.1哮喘模型建立與分組 小鼠隨機分為對照組(control)、模型組(model)、番茄紅素低劑量組(LYC 50 mg/kg)和番茄紅素高劑量組(LYC 100 mg/kg)。模型組、番茄紅素組小鼠于第1、7、14天腹腔注射OVA(10 μg)+氫氧化鋁(1 mg)的生理鹽水混合液200 μl，對照組注射等量生理鹽水。第21天將致敏小鼠置于玻璃罩內，每組以OVA(0.1 g)生理鹽水混合液10 ml霧化吸入30 min，1次/d，共7 d。治療組在激發前分別灌服番茄紅素50 mg/kg或100 mg/kg，共計7 d。

1.2.2實驗樣本獲取與處理 將小鼠于末次激發48 h后麻醉致死，以1 ml生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，收集BALF，血球計數儀計細胞總數。剩余BALF在4℃，1 000 r/min離心5 min，取上清液，-80℃保存，待測細胞因子。離心沉淀涂片后Diff-quik染色，進行細胞分類計數。取右肺下葉，10%(v/v)甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，HE染色觀察肺部炎癥情況。其余各肺葉放入液氮中速凍，-80℃保存待用。

1.2.3BALF中細胞因子IL-4、IL-5和IL-13含量的檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定，具體操作按試劑盒說明書進行，結果單位以pg/L表示。

1.2.4BALF和肺組織中ROS的檢測 BALF離心涂片，500 mg右肺組織樣品制備勻漿(10%，w/v)，按照說明書裝載DCFH-DA探針，cytation5成像系統或流式細胞儀488 nm激發波長，525 nm發射波長條件下進行檢測。

1.2.5ROS、MDA和SOD的檢測 取500 mg右肺組織樣品制備勻漿(10%，w/v)。根據試劑盒說明書進行操作，測定ROS、MDA水平以及SOD活性。

1.2.6Western blot分析 肺組織制備勻漿，裂解后獲取蛋白，BCA方法測定蛋白濃度，每泳道加入20 μg 樣本，進行電泳及轉膜，50 g/L脫脂奶粉TBS-T緩沖液孵育封閉膜上非特異性位點，按照抗體比例進行稀釋后孵育2 h。洗膜后再用HRP標記的二抗雜交，室溫孵育2 h。清洗后加入ECL發光試劑，利用Amersham Imager 600凝膠成像系統成像并分析。

1.2.7氣道高反應性(AHR)檢測 最后一次OVA激發后48 h，將清醒的大鼠置于體描室，記錄3 min內平均基線讀數，采用乙酰甲膽堿(從2.5至50 mg/ml)進行霧化3 min，記錄平均讀數。根據制造商的方案計算增強呼氣間歇(Penh)，作為氣道縮窄指數來反映氣道高反應的程度。

2 結果

2.1番茄紅素對哮喘小鼠BALF中細胞總數及各分類細胞數的影響 如表1所示，模型組小鼠BALF中細胞總數明顯高于對照組，且嗜酸性粒細胞，中性粒細胞和淋巴細胞數均顯著升高(P<0.05)；番茄紅素灌胃治療后，哮喘小鼠BALF中各項指標明顯下降(P<0.05)。

2.2番茄紅素對哮喘小鼠肺部炎癥的影響 觀察哮喘小鼠肺部炎癥變化，HE染色結果顯示，模型組存在明顯的氣道平滑肌增厚，黏液分泌過多以及大量的炎性細胞浸潤。而番茄紅素治療組小鼠肺組織氣道上皮無明顯增厚，肺泡壁較完整，炎性細胞明顯減少。

GroupsTotal cells(×104/ml)Lymphocytes(×104/ml)Neutrophils(×104/ml)Eosinophils(×104/ml)Control8.35±0.970.37±0.080.54±0.061.06±0.20Model24.88±3.011)3.45±0.841)2.07±0.411)13.42±2.461)LYC 50 mg/kg18.26±2.832)2.69±0.122)1.48±0.222)9.27±1.312)LYC 100 mg/kg12.44±1.072)1.97±0.262)1.06±0.092)6.55±0.722)

Note：Compare with control,1)P<0.05;compare with model,2)P<0.05.

2.3梓醇對BALF和肺組織中IL-4、IL-5和IL-13水平的影響 如表2所示，ELISA結果表明，與正常對照組比較，模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯增高(P<0.05)；番茄紅素明顯降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平(P<0.05)。與Western blot結果一致(圖2)。

圖1 番茄紅素對哮喘小鼠肺部炎癥的影響(×200)

GroupsIL-4(pg/ml)IL-5(pg/ml)IL-13(pg/ml)Control76.51±10.0768.37±11.9652.24±9.33Model402.71±40.661)377.45±38.62195.76±32.981)LYC 50 mg/kg295.10±37.432)264.39±40.092)127.55±14.312)LYC 100 mg/kg147.39±19.642)128.92±20.062)84.18±10.882)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with model,2)P<0.05.

圖2 番茄紅素對哮喘小鼠肺組織中IL-4、IL-5和IL-13表達的影響

2.4番茄紅素對哮喘小鼠AHR的影響 如圖3所示，與對照組相比，模型組小鼠氣道反應明顯增高(P<0.05)；而番茄紅素能夠抑制哮喘小鼠的氣道高反應(均P<0.05)。

2.5番茄紅素對哮喘小鼠肺部氧化應激的影響 如圖4所示，模型組小鼠肺部ROS和MDA水平明顯升高，而抗氧化酶SOD活性明顯下降(P<0.05)；番茄紅素能夠有效降低哮喘小鼠肺部ROS和MDA水平并提高SOD活性(P<0.05)。

2.6番茄紅素對PI3K/AKT/NF-κB信號通路的影響 如圖5所示，模型組p-PI3K、 p-AKT以及p-p65表達水平明顯升高(P<0.05)，而番茄紅素和NAC處理后，蛋白表達明顯降低(P<0.05)。

圖3 番茄紅素對哮喘小鼠AHR的影響

圖4 番茄紅素對哮喘小鼠肺部氧化應激的影響

圖5 番茄紅素對PI3K/AKT/NF-κB的影響

3 討論

哮喘是一種復雜的臨床綜合征，以炎癥、氣道高反應性和重塑為特征，與活性氧生成增加和抗氧化防御功能受損有關[5]，是全球范圍內最常見的過敏性疾病之一。研究表明[6]，哮喘主要由適應性免疫介導，其中Th2型細胞因子具有重要作用，Th2細胞遷移到氣道上皮細胞后分泌2型細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等，參與黏液分泌，氣道重塑和AHR。番茄紅素是一種重要的紅色非氧類胡蘿卜素，以往對其生物學功能的研究主要集中在抗氧化、降低心血管疾病的風險、減少基因損傷和抑制腫瘤生長等[7]，而針對哮喘方面的作用尚未有明確報道。本研究實驗結果表明，番茄紅素能夠抑制哮喘小鼠BALF中炎癥細胞浸潤，降低BALF和肺組織中IL-4、IL-5和IL-13水平，改善肺組織病理學，抑制氣道高反應性，表明番茄紅素具有抗哮喘作用。

氧化應激是誘導細胞內重要生物分子和亞細胞結構損傷的多種細胞通路的基礎，由ROS等多種活性物質共同參與。ROS是一組不穩定的、具有高度活性的分子或自由基，在免疫、細胞生長和細胞信號傳導中發揮重要作用。哮喘進程中，氣道中浸潤炎癥細胞以及氣道結構細胞會產生大量的ROS，高水平的ROS加劇了氣道對過敏原激發的反應，并對氣道功能造成了許多不利影響，包括氣道平滑肌收縮，AHR誘導，黏液分泌過多，上皮脫落和血管滲出[8-10]。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是氧化應激的一種生物標志物，能夠提示細胞脂質過氧化的水平。以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)為主的一線防御抗氧化劑能夠破壞超氧自由基，在機體抗氧化防御系統中是必不可少的。本研究發現，番茄紅素處理后，哮喘小鼠肺部ROS水平、MDA水平明顯下降，SOD活性明顯提高，表明番茄紅素處理后能夠明顯抑制哮喘小鼠肺部氧化應激。

ROS是調節細胞活動的關鍵信號轉導分子，能夠參與多種細胞信號傳導途徑的調控。Phospho-inositide 3-kinase/protein kinase B(PI3K/AKT)信號通路是參與外部刺激反應的重要細胞級聯。PI3K激活下游信號分子AKT，并在多種生物反應中發揮重要作用，包括炎癥、細胞增殖和細胞凋亡等[11]。研究表明，ROS能夠激活PI3K/AKT信號通路，促進轉錄因子，如核轉錄因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB)的激活[12]。NF-κB屬于誘導核轉錄因子家族，能夠調節炎癥反應，除了協調先天免疫細胞中各種促炎基因的誘導，NF-κB還能調節炎癥T細胞的活化、分化和效應功能，誘導IL-4等促炎細胞因子表達[13,14]，導致氣道纖維化，平滑肌細胞增殖以及肺部黏液量增加，進一步加重哮喘。本研究結果表明，番茄紅素能夠抑制哮喘小鼠肺部p-PI3K、p-AKT以及p-p65表達。暗示番茄紅素可能通過調控ROS抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路。綜上所述，本研究表明，番茄紅素可能通過抑制ROS調控的PI3K/AKT/NF-κB通路發揮其抗哮喘作用。