白茅苷抑制AKT的活化對宮頸癌細胞增殖、凋亡和線粒體膜電位的影響①

吉 潔 馬志君 曹振東 邵雪齋 申興斌 王曉芬

(承德醫學院附屬醫院，承德 067000)

宮頸癌是發展中國家最常見的癌癥類型之一，是世界第四位最常發生的婦科癌癥[1]。宮頸癌的治療是手術、化療和放療[2]。但由于癌癥具有增殖，侵襲和遷移的強大能力，晚期宮頸癌患者的預后仍然較差，其5年生存率約為16.5%[3]。因此，靶向抑制增殖、侵襲和遷移的有效抗癌劑對宮頸癌患者具有高度科學和臨床價值。白茅苷也稱歐前胡素，是提取自中藥白芷、獨活和當歸中的有效成分，具有散風除濕、通竅止痛、消腫排膿、解熱鎮痛、抗炎、抗腫瘤的功效[4]。已有研究表明歐前胡素通過靶向于Mcl-1增強多柔比星對宮頸癌細胞的殺傷活性[5]，但白茅苷對宮頸癌治療的具體機制仍尚不清楚。本文旨在研究白茅苷對宮頸癌細胞增殖，凋亡和線粒體膜電位的影響。

1 材料與方法

1.1材料 白茅苷(I6659)購自美國Sigma-Aldrich，化學式：C16H14O4，分子量：270.28，純度≥98；Dulbecco′s modified Eagle′s medium培養基(12100-046)、胎牛血清(10082-147)、胰蛋白酶(25200-056)、青-鏈霉素(15140-122)購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒(C0037)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062S)購自上海碧云天生物技術研究所；Anti Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、Bax(ab53154)、Bcl-2(ab196495)、AKT(ab18787)購自美國Abcam公司，宮頸癌SiHa細胞株來源于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞培養于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養基中，并放置在37℃，5% CO2恒溫培養箱中。培養基每2～3 d更換一次，當需要收集細胞時，用0.25%胰蛋白酶消化。試驗用細胞為對數生長期細胞。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力 將宮頸癌SiHa細胞接種于96孔板(100 μl/孔)孵育24 h后,用不同劑量(0、1、2.5、5、10、25、50、100、200、300、400、500 μmol/L)處理細胞，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h，在450 nm處用酶標儀測定OD值。

1.2.3細胞分組 采用無顯著毒性的25、50、100 μmol/L 進行后續實驗，將細胞隨機分為四組：對照組(0 μmol/L)、低劑量組(25 μmol/L)、中劑量組(500 μmol/L)、高劑量組(100 μmol/L)。

1.2.4克隆形成法檢測細胞增殖 在培養皿中培養細胞至大約30%匯合度，繼續培養4 d，吹散為單個細胞，用6孔板培養，約500個細胞每孔，培養14 d，棄掉培養基，用乙醇固定30 min，接著用0.5%結晶紫染色，用去離子水漂洗晾干，進行拍照觀察。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集懸浮細胞到10 ml的離心管中，每樣本細胞數為3×106ml-1，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養液，用孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r/min離心5 min，用100 μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，500～1 000 r/min離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20 min，避光，不時振動，流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.2.6RT-PCR 用Trizol法從宮頸癌SiHa細胞中提取總RNA,用Nanodrop 分光廣度計測定吸光度(A260/A280)，按照試劑盒說明書進行cDNC的合成和PCR的擴增，反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s，擴增35個循環;72℃延長10 min;存儲在4℃條件下。反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.2.7線粒體膜電位 將各組細胞接種于6孔板后PBS清洗3次，孵育24 h，加入JC-1(5 μg/ml)室溫避光反應30 min。用流式分選儀檢測，記錄紅色和綠色熒光強度。

1.2.8Western blot 首先將各組待測細胞用PBS將清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質含量；提取等量的蛋白質樣品(20 mg)，100℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用Image J軟件統計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復3個獨立的實驗。

1.2.9免疫熒光檢測 將細胞接種于細胞爬片上，用PBS浸洗3次，每次3 min；用多聚甲醛固定15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，吸掉封閉液，加入一抗，孵育過夜，PBS浸洗，避光加入熒光二抗，孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結果

2.1白茅苷抑制宮頸癌SiHa細胞活力 采用CCK-8檢測宮頸癌SiHa細胞活力，結果如圖1所示。與0 μmol/L劑量相比較，200、300、400和500 μmol/L 劑量細胞存活率顯著降低(P<0.05)。

2.2白茅苷抑制宮頸癌SiHa細胞增殖 采用克隆形成法檢測各組細胞增殖情況如圖2所示。與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 50、100 μmol/L 組細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。

2.3白茅苷促進宮頸癌SiHa細胞凋亡 采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡結果如圖3所示。與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 50、100 μmol/L 組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 白茅苷對細胞活力的影響

圖2 白茅苷對細胞增殖的影響

圖3 白茅苷對細胞凋亡的影響

圖4 白茅苷對線粒體膜電位的影響

表1 白茅苷對Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平的影響

Tab.1 Effects of Imperatorin on mRNA levels of Ki67,PCNA and Bcl-2/Bax

GroupsKi67 mRNA(2-ΔΔCt)PCNA mRNA(2-ΔΔCt)Bcl-2/Bax Imperatorin 0 μmol/L113.36±0.54Imperatorin 25 μmol/L0.95±0.120.98±0.072.09±0.321)Imperatorin 50 μmol/L0.64±0.541)0.53±0.061)0.82±0.081)Imperatorin 100 μmol/L0.17±0.611)0.22±0.041)0.15±0.041)

Note:Compared with Imperatorin 0 μmol/L，1)P<0.05.

2.4白茅苷降低Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平 采用RT-PCR檢測各組細胞Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平，結果如表1所示。與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 50、100 μmol/L組Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平顯著降低(P<0.05)。

圖5 白茅苷對AKT磷酸化的影響

2.5白茅苷降低宮頸癌SiHa細胞線粒體膜電位 采用流式分選檢測細胞線粒體膜電位的變化結果如圖4所示。Imperatorin 50、100 μmol/L組較Imperat-orin 0 μmol/L組細胞線粒體膜電位明顯降低。

2.6白茅苷抑制AKT磷酸化 采用Western blot檢測p-AKT/AKT比值結果如圖5A所示，與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 25、 50、100 μmol/L組p-AKT/AKT比值顯著降低(P<0.05)；采用免疫熒光檢測AKT的細胞定位情況結果如圖5B所示，與Imperatorin 0 μmol/L組相比較，Imperatorin 25、 50、100 μmol/L組熒光表達顯著降低(P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是婦科腫瘤中發病率最高的惡性腫瘤之一，其發病率呈現上升趨勢，嚴重威脅女性健康[6]。由于宮頸癌目前的一線化療藥物，如多柔比星、順鉑在經過重復用藥啊，腫瘤細胞往往會產生耐藥性[7]。因此，針對宮頸癌發病機制，需要探尋新型有效的抗宮頸癌藥物。白茅苷是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質，據報道白茅苷對多種腫瘤具有抑制作用[8]。

宮頸癌難以治療的原因之一是由于癌細胞的無限增殖。增殖細胞核抗原(PCNA)、Ki-67是與細胞增殖相關的核抗原,是近年來廣泛應用的細胞增生標記物，PCNA是DNA聚合酶的一種輔蛋白,其與細胞增殖加快密切相關[9]。Ki-67為增殖細胞核相關抗原，是反映細胞增殖狀態的理想標記物[10]。本文研究發現，白茅苷具有抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，降低PCNA、Ki-67 mRNA水平的作用。說明白茅苷通過抑制細胞增殖對宮頸癌具有治療作用。

凋亡即細胞的程序性死亡，是在組織發育和體內平衡中起關鍵作用的基本生理過程，細胞凋亡通過消除舊的、不必要的和患病的細胞在體內發育和維持中起關鍵作用[11]。細胞凋亡主要有外源性凋亡途徑、內源性凋亡途徑和內質網應激途徑[12]，內在凋亡途徑中的關鍵事件是線粒體外膜的透化，其響應于各種刺激而發生，并且受若干細胞質蛋白調節，包括Bcl-2家族成員[13]。抗細胞凋亡成員Bcl-2，可防止細胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細胞質，并在應激下寡聚化，促進線粒體釋放因子，從而引發細胞凋亡[14]。誘導細胞凋亡的藥劑可能是宮頸癌治療的理想藥物，Sikander等[15]研究發現葫蘆素D通過促進宮頸癌細胞凋亡對宮頸癌具有治療作用。Tsai等[16]研究發現甘草查爾酮A通過促進宮頸癌SiHa細胞凋亡治療宮頸癌。本文研究發現白茅苷具有促進宮頸癌SiHa細胞凋亡，降低Bcl-2/Bax比值的作用，提示白茅苷對宮頸癌具有治療作用。

線粒體是一種存在于大多數細胞中有兩層膜包被的細胞器，是細胞中制造能量的結構。線粒體通透性孔的轉換對細胞的凋亡有著至關重要的作用,一旦線粒體通透性孔打開,小分子和離子就會流進線粒體,導致線粒體膜電位的改變[17]。線粒體膜內外的電勢差降低，可引起線粒體一系列的生化反應，如誘導細胞色素C釋放，活化caspase蛋白酶家族，線粒體膜通透性改變，凋亡誘導因子AIF釋放等，引起細胞凋亡的級聯反應，導致細胞凋亡。馬依努爾等[18]研究發現異甘草素通過降低線粒體膜電位抑制宮頸癌SiHa細胞增殖。劉志剛等[19]研究發現丹參酮ⅡA通過降低線粒體膜電位抑制SiHa細胞增殖并誘導其凋亡。本文研究發現白茅苷具有降低宮頸癌SiHa線粒體膜電位的作用，提示白茅苷抑制細胞增殖，促進細胞凋亡可能是通過降低線粒體膜電位實現的。

Akt及其信號通路是基礎研究和藥物研發領域中最熱門的激酶和激酶通路之一[20]。PI3K/AKT信號通路在細胞增殖與凋亡的異常調節途徑中發揮重要作用,AKT在該通路中起核心作用,活化的AKT通過作用下游效應分子,使細胞存活、增殖、抑制凋亡,與腫瘤的發生、侵襲轉移密切相關[21]。本文研究發現，白茅苷具有降低宮頸癌細胞SiHa細胞p-AKT/AKT比值、AKT熒光表達的作用，說明白茅苷通過抑制AKT的活化調節宮頸癌細胞SiHa的增殖、凋亡和線粒體膜電位。

綜上所述，本文揭示了白茅苷對宮頸癌細胞SiHa的影響：抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，降低Ki67、PCNA、Bcl-2/Bax mRNA水平，降低線粒體膜電位，降低p-AKT/AKT比值、AKT熒光表達。為白茅苷臨床應用治療宮頸癌提供了實驗依據。