雞軟骨肽化學結構特征及抗氧化、抗炎活性成分研究

尹西拳 梁 明 胡明華 羅 丹 丁劉剛 林曉亮 劉 衛②

(無限極(中國)有限公司，廣州 510663)

雞軟骨肽，是以動物雞(Gallus gallus)的胸軟骨為原料，通過生物可控的酶解技術制備而得的多肽混合物。雞軟骨肽中富含關節軟骨所需的Ⅱ型膠原蛋白、硫酸軟骨素以及其他活性多肽，其對關節炎、骨質疏松癥等關節和骨骼的退行性疾病具有防治作用[1，2]。有報道指出膠原蛋白肽可通過多種途徑發揮關節保護作用[3]，如：刺激關節軟骨產生Ⅱ型膠原蛋白、透明質酸、黏多糖、蛋白多糖等活性物質發揮修復作用；增加成骨細胞的數量和分化；減少破骨細胞介導的骨吸收等。 其次雞軟骨中的硫酸軟骨素作為結締組織天然存在的重要成分，與膠原蛋白一起發揮關節保護作用[4，5]。目前關于雞軟骨肽發揮關節保護作用的物質基礎研究報道較少，本實驗借助LC-MS/MS以及物種蛋白質數據庫對雞軟骨肽化學組成及抗氧化、抗炎活性成分進行研究，相關成果將為雞軟骨肽在保健食品及藥品中的應用提供方法學和實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1材料 雞軟骨肽，以雞胸軟骨為原料，通過生物可控的酶解技術制備而得的多肽混合物，采用凱氏定氮法測得其蛋白含量為73.7%；合成多肽由合肥國肽生物科技有限公司合成并提供；ANT-300全自動定氮儀(上海洪紀儀器設備有限公司)；ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Q Exactive質譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；多標記酶標儀(美國Perkin Elmer公司)；IL-1β試劑盒、PGE2 試劑盒、TNF-α試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；C518大鼠膝關節軟骨細胞由實驗室培養，培養條件為DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2。

1.2實驗方法

1.2.1氨基酸組成分析 采用異硫氰酸苯酯(PITC)-柱前衍生高效液相色譜法檢測雞軟骨肽水解后所得氨基酸的組成，結合文獻報道[6-10]，雞的氨基酸組成主要包括16種氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)，羥脯氨酸和羥賴氨酸分別是軟骨中膠原蛋白的重要成分之一，因此本實驗以上述18種氨基酸作為標準品。具體方法如下：分別稱取適量上述十八種氨基酸對照品，用0.1 mol/L的稀鹽酸溶解，配成濃度為50 μg/ml的氨基酸標準品溶液。分別吸取適量十八種氨基酸標準品溶液，混合均勻，得氨基酸標準品混合液。稱取0.1 g雞軟骨肽樣品，加入0.5%苯酚的50%的鹽酸4 ml，于安瓿瓶中熔封，150℃加熱1 h，過濾，揮干溶劑，再加入5 ml 0.1 mol/L的稀鹽酸溶解，得雞軟骨肽樣品溶液。

吸取200 μl十八種氨基酸標準溶液(或樣品溶液)于1.5 ml EP管中，再加入100 μl三乙胺溶液和100 μl PITC溶液，混合均勻后，于40℃水浴條件下反應1 h后，加入400 μl正己烷，渦旋振蕩后靜置30 min，取下相200 μl加800 μl水混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。所有供試品溶液將采用以下條件進行HPLC分析[氨基酸專用柱Sepax AAA4.6×250 mm，5 μm；流動相A：0.1 mol/L醋酸銨(pH6.5)∶乙腈=93∶7；流動相B ：80%乙腈水溶液；柱溫：36℃；流速：1.0 min；檢測波長：245 nm；進樣量：10 μl]。

1.2.2氨基酸測序 稱量雞軟骨肽樣品適量，加入離子水使其完全溶解，并使樣品溶液濃度為100 mg/ml。樣品溶液采用 C18 小柱進行除鹽，具體操作如下：C18小柱依次加入 1 ml 100%乙腈溶液、1 ml 0.1%的 TFA 溶液，然后加入1 ml樣品溶液，控制流速，使溶液緩慢流出，重復一次；加入 800 μl 0.1%的 TFA，重復一次；加入 500 μl的洗脫液(50%CAN，0.1%TFA)，并收集流出溶液，重復一次，合并溶液。所得流出液即雞軟骨肽洗脫液，凍干，樣品保存在-20℃冰箱待用。

凍干樣品用800 μl 0.1%甲酸溶液溶解，9 000 r/min離心10 min，取上清15 μl于進樣瓶中進行液質聯用(LC-MS/MS)分析。液相為ACQUITY UPLC (waters)，進樣1 μl，色譜柱為C18，3 μm，250 mm×75 μm(Eksigent)。60 min色譜梯度，3.0 μl/min的色譜流速，1張MS譜中選10個強度最高的離子進行MS/MS分析，質譜分析在Q Exactive(thermo)上進行。

獲得雞軟骨肽MS/MS離子碎片峰信息后，將所得質譜數據在NCBI物種 (Gallus gallus)蛋白質數據庫中進行搜庫檢索，搜庫條件：串聯質譜檢索(MS/MS Ion Search)；Trypsin酶切；M氧化和碘乙酰胺烷基化為可變修飾；漏切位點為1；Peptide質量誤差為±10 ppm；Fragment質量誤差為±0.05 Da。搜庫檢索后，利用MASCOT軟件打分，選擇卡值 ion score>35的雞軟骨肽多肽片段(大于35分即成功鑒定，可靠性達到顯著水平)，即為雞軟骨肽代表肽段。

1.2.3雞軟骨肽代表肽段體外抗氧化能力評價 對雞軟骨肽代表肽段采取固相合成的方法進行制備，使各多肽純度達到95%以上，凍干保存。

①DPPH法測定雞軟骨肽代表肽段抗氧化能力：以蒸餾水、5%的DMSO溶液為空白對照，分別取蒸餾水、5%DMSO、樣品溶液150 μl，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液150 μl，渦旋混勻后，于暗處反應90 min，即得供試品溶液。用紫外分光光度計在517 nm測定其吸光度，并計算各樣品DPPH清除率。DPPH清除率(%)=1-Ax/A0×100%Ax表示樣品在517 nm處的吸光度，A0表示空白對照組在517 nm處的吸光度。②水楊酸法測定雞軟骨肽代表肽段清除羥基自由基的能力 以蒸餾水、5%的DMSO溶液為空白對照，分別取蒸餾水、5% DMSO、樣品溶液(4 mg/ml)50 μl，加入4 mmol/L FeSO4溶液50 μl，4 mmol/L 水楊酸無水乙醇溶液50 μl，混合搖勻，放置10 min后，再向其中加入4 mmol/L H2O2溶液50 μl，混合搖勻，在37℃條件下反應20 min后，即得供試品溶液。用紫外分光光度計在510 nm處測定各溶液吸光度，并計算各樣品對羥基自由基的清除率。羥基自由基清除率(%)=1-Ax/A0×100%。Ax表示樣品在510 nm處的吸光度，A0表示空白對照組在510 nm處的吸光度。③FRAP方法測定雞軟骨肽代表肽段總抗氧化能力 取FeSO4標準溶液/樣品溶液(4 mg/ml)100 μl，分別加入1 ml新鮮配制的TPTZ工作液，混合搖勻，在37℃反應10 min后，紫外分光光度計于593 nm測定其吸光度，計算標準溶液線性方程，樣品溶液吸光度代入方程并計算結果。

樣品總抗氧化能力以FeSO4標準溶液表示，FRAP表示為每1克樣品相當于FeSO4的摩爾數(nmol/g)。

1.2.4雞軟骨肽代表肽段對H2O2致C518大鼠膝關節軟骨細胞氧化損傷的保護作用評價 將C518大鼠膝關節軟骨細胞用1 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化40 s后，加入DMEM完全培養基終止消化，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入DMEM完全培養基重懸細胞，再將C518 大鼠膝關節軟骨細胞按3×104個/ml接種于96孔板，待細胞貼壁后，設置空白組、模型組(1.0 mmol/L H2O2)、候選代表肽組(1.0 mmol/L H2O2+1.0 mg/ml各候選代表肽)，培養24 h后加入CCK-8試劑10 μl，反應3 h后于450 nm測定各孔OD值。

1.2.5雞軟骨肽代表肽段對LPS誘導的C518大鼠膝關節軟骨細胞炎癥模型的抗炎作用評價 采用體外脂多糖(LPS)刺激C518大鼠膝關節軟骨細胞建立炎癥模型，并給予雞軟骨肽代表肽段進行干預，觀察C518細胞分泌的相關炎癥因子的變化，以此對雞軟骨肽代表肽段抗炎活性進行評價。

將C518大鼠膝關節軟骨細胞用1 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化40 s后，加入DMEM完全培養基終止消化，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入DMEM完全培養基重懸細胞，再將C518 大鼠膝關節軟骨細胞按1×105個/ml接種于96孔板中，待細胞貼壁后，設置空白組、模型組(10 μg/ml LPS)、雞軟骨肽代表肽段組(10 μg/ml LPS+1.0 mg/ml各雞軟骨肽代表肽段)，培養24 h后，收集培養基上清液(-20℃保存備用)，分別測定上清液中IL-1β、PGE2、TNF-α 3種炎癥因子的含量。

1.3統計學處理 用SPSS16.0 軟件進行實驗數據的統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗，P<0.05認為差異存在明顯統計學意義。

2 結果

2.1氨基酸組成分析結果 通過對18種氨基酸混合液、水解雞軟骨肽樣品的柱前衍生HPLC檢測結果進行峰面積占比計算，獲得18種氨基酸在雞軟骨肽中的占比情況，結果見圖1。其中占比最高的是甘氨酸(G)29.5%，其次為脯氨酸(P)11.63%、丙氨酸(A)10.61%、谷氨酸(E)9.2%。

圖1 雞軟骨肽氨基酸組成

表1 雞軟骨肽代表肽段氨基酸序列及分子量

Tab.1 Amino acid sequence and molecular weight of chicken cartilage peptides

No.AbbreviationSequenceMW(Da)1G1VAIQAVLSLYASGR1 446.822G2SYELPDGQVITIGNER1 789.893G3ESYVETELIFALAK1 611.844G4MEGNAEESTLFCFAVRG1 859.825G5IAEEFEVELER1 362.676G6GPRGPPGPVGP986.537G7FFWEMAEEEGWIR1 728.768G8GRPGPPGPVGP986.539G9MPSPLPRS883.4610G10ELSDSSDGLEVK1 277.6011G11GPAGPSGPR794.40

2.2氨基酸測序結果 對雞軟骨肽質譜數據進行NCBI物種蛋白數據庫搜庫檢索后，共得到3 077條肽段，選擇MASCOT軟件打分，在卡值 ion score>35的條件下，共確定11個雞軟骨肽代表肽段，氨基酸序列和分子量信息見表1。

2.3雞軟骨肽代表肽段體外抗氧化能力評價結果 結果見圖2、3。在DPPH清除率方面，G4、G3、G2、G1活性最強；在OH·清除率方面，G4、G5、G10、G7活性最強；在FRAP總抗氧化能力方面，G3、G1、G2活性最強。對11條多肽分別按照DPPH清除率、OH·清除率、FRAP檢測數據大小進行排序，獲得綜合抗氧化能力強弱排序為G4、G3、G2、G1、G10、G5、G11、G7、G6、G9、G8。

2.4雞軟骨肽代表肽段對H2O2致C518大鼠膝關節軟骨細胞氧化損傷的保護作用評價結果 結果見圖4。經濃度為1 mmol/L的H2O2溶液處理后，模型組細胞損傷率達到69.7%，與空白組相比，有極顯著性差異，表明此次造模成功。各代表肽組與模型組相比，均存在極顯著差異，說明候選的11條代表肽都能不同程度抵抗H2O2對C518細胞造成的氧化性損傷，且效果明顯。在候選代表肽中，對C518細胞氧化損傷保護作用較強的肽段依次為G10、G1、G4、G9、G11等代表肽段。

圖2 雞軟骨肽代表肽段的抗氧化能力(DPPH清除率、OH·清除率)

圖3 雞軟骨肽代表肽段抗氧化能力評價(FRAP value)

2.5雞軟骨肽代表肽段對LPS誘導的C518大鼠膝關節軟骨細胞炎癥模型的抗炎作用評價結果 結果見圖5。在11條雞軟骨肽代表肽段中，只有G4能夠顯著降低IL-1β水平(P<0.05)，其余無顯著性差異；G1、G2、G9能夠顯著降低PGE2水平(P<0.05)，其余無顯著性差異；G4、 G1、G3、G5、G6、G7、G9、G10、G11能夠顯著降低TNF-α水平(P<0.05)，其中G4組效果最為明顯(P<0.01)。綜合來看，G4抗炎效果最優，其次為G1、G9、G7。

圖4 雞軟骨肽代表肽段對H2O2致C518大鼠膝關節軟骨細胞氧化損傷的影響(以OD值計)

圖5 雞軟骨肽代表肽段對LPS誘導的C518大鼠膝關節軟骨細胞炎癥模型的抗炎作用

3 討論

本實驗發現雞軟骨肽的氨基酸組成以甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、谷氨酸(Q)為主，占比超過60%，與吳雷等[8]報道的檢測結果基本一致[9，10]。但由于本實驗所用原料為雞軟骨酶解混合多肽，并未進行膠原蛋白的純化，其羥脯氨酸占比偏低。將雞軟骨肽氨基酸組成與鑒定出的11條雞軟骨肽肽段進行對比可知，G2(SYELPDGQVITI-GNER)、G4(MEGNAEESTLFCFAVRG)、G6(GPRGPPGPVGP)、G8(GRPGPPGPVGP)、G11(GPAGPS-GPR)等五個肽段的氨基酸組成與雞軟骨肽的整體氨基酸組成相似度相對較高。

進一步對雞軟骨肽代表肽段抗氧化、抗炎作用分析發現，DPPH清除率、OH·清除率、FRAP三個指標的抗氧化綜合能力強弱排序為G3、G2、G4、G1、G10、G5、G11、G7、G6、G9、G8，對H2O2致C518細胞氧化損傷保護作用較強的肽段依次為G10、G1、G4、G9、G11，對LPS誘導的C518大鼠膝關節軟骨細胞的抗炎作用較強的肽段依次為G4、G1、G9、G7。綜合抗氧化、抗炎作用評價結果，可知G4綜合功效最佳，其次為G1。而G4的氨基酸組成與雞軟骨肽的整體氨基酸組成相似度相對較高，推測G4(MEGNAEESTLFCFAVRG)可能是雞軟骨肽的主要活性片段之一。

綜上所述，本實驗在確定雞軟骨肽氨基酸組成的基礎上，進一步借助LC-MS/MS以及物種蛋白質數據庫鑒定出11個氨基酸序列清晰、分子量明確的雞軟骨肽代表肽段，并確定了多條抗氧化、抗炎活性顯著的雞軟骨肽代表肽段。本實驗是對于雞軟骨肽化學結構特征及功效的初步探索研究，相關研究成果將為雞軟骨肽在保健食品及藥品中的應用提供方法學和實驗數據支持。未來還可通過對雞軟骨肽進行純化，并結合蛋白質測序等更精準的檢測方法，深入開展化學結構特征研究。