腦梗死大鼠腦組織生長分化因子-15的表達及其與神經功能損害的關系①

焦光美 單海雷 康玲伶 張曉璇 馬 征 竇志杰 趙 亮 馮亞茹 楊 寧

(承德醫學院附屬醫院神經內科，承德 067000)

腦梗死是常見的腦血管疾病，是由于腦供血不足引起的腦組織缺血性壞死，腦梗死在中老年人群中高發，隨著我國人口的不斷老齡化，腦梗死的發生率有不斷上升趨勢；以動脈粥樣硬化為基礎的腦梗死是最常見的病理類型[1]，血管壁炎癥反應在動脈粥樣硬化的各個階段具有重要作用，與動脈粥樣硬化相關的炎癥因子越來越受到重視，GDF-15與發轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員之一，是一種應激蛋白，在心腦血管疾病、炎癥、腫瘤等情況下GDF-15水平升高[2]，研究發現GDF-15與心肌梗死等心血管疾病關系密切[3,4]，關于GDF-15與腦梗死的研究較少，有研究發現血清GDF-15與急性缺血性腦卒中關系密切，而GDF-15在腦梗死組織中的表達及其在腦梗死發生中的機制尚不十分清楚。本文通過建立腦梗死大鼠模型，研究腦梗死大鼠腦組織中GDF-15表達情況及意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級健康SD大鼠45只，雄性，體重230～250 g，購自北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司，許可證號：SYXK(京)2014-0017。

1.1.2主要試劑 伊紅、蘇木素等(國藥集團化學試劑有限公司)，GDF-15單克隆抗體、Smad2單克隆抗體、Smad4單克隆抗體、p21單克隆抗體、GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗兔抗體、BCA試劑盒(美國Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及建模 45只大鼠根據隨機數字法分為腦梗死組、假手術組和正常對照組，每組15只，腦梗死組大鼠采用線栓法制作腦梗死動物模型：大鼠麻醉后仰臥固定于動物手術臺上，暴露頸部皮膚，消毒后剪開頸部皮膚，分離大鼠頸總動脈、頸內動脈以及頸外動脈，頸外動脈遠心端結扎，頸內動脈遠心端和頸總動脈近心端放置動脈夾，剪斷頸外動脈結扎處，插入栓線至頸內動脈處，將頸內動脈夾打開繼續推進栓線至遇到阻力為止，阻斷大腦中動脈血流，固定栓線、縫合皮膚，2 h后拔出栓線。假手術組大鼠暴露頸內動脈后直接縫合皮膚。正常對照組不予處理。大鼠建模后表現為右側轉圈障礙、右前爪不能伸展，表明腦梗死模型建立成功。建模后腦梗組大鼠死亡2只，存活13只；假手術組和正常對照組大鼠無異常表現，兩組15只均存活。

1.2.2大鼠神經功能mNSS評分 建模后1周，對各組大鼠進行感覺、運動、反射活動、平衡木四個方面的神經功能mNSS評分測定，mNSS評分為0～18分，分值越高表明神經功能損傷越嚴重。

1.2.3大鼠腦組織采集 各組大鼠神經功能mNSS評分測定后，麻醉各大鼠，麻醉成功后，將大鼠固定到手術臺上，斷頭取各大鼠腦組織進行HE染色、Western blot和RT-PCR測定。

1.2.4大鼠腦組織HE染色 將各大鼠腦組織進行常規石蠟包埋，切成厚4 μm厚切片，經甲醛固定，常規進行HE染色，顯微鏡下觀察各大鼠腦組織病理學變化，并進行TTC染色測量腦梗死面積。每只大鼠取5個視野計算腦梗死面積，腦梗死面積以腦梗死面積/腦組織總面積×100%表示。

1.2.5大鼠腦組織中GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平測定 將各組大鼠腦組織放入EP管中，加入蛋白裂解液研磨均勻，反應30 min，13 000 r/min離心15 min，留取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，采用Western blot法測定大鼠腦組織中GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平，以GDF-15單克隆抗體、Smad2單克隆抗體、Smad4單克隆抗體為一抗、p21單克隆抗體為一抗，以GAPDH為內參照，以羊抗鼠抗體作為二抗進行Western blot測定。GDF-15、Smad2、Smad4p21蛋白的相對表達量=GDF-15、Smad2、Smad4p21蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.6大鼠腦組織中GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平測定 將各組大鼠腦組織標本研磨成粉末，再加入Trizol研磨，收集懸液，提取腦組織總RNA，采用RT-PCR測定腦組織中GDF-15(上游引物：5′-AGGTGTGTTGAGAGGATGAGAGATATTAG-3′，下游引物：5′-AAAACAATCATCCTTATCC-AAAACCT-3′)、Smad2(上游引物：5′-CCATCCCCGACAAGACTAACTT-3′，下游引物：5′-TGGTGGTCGATAGTTTGTCCAT-3′)、Smad4(上游引物：5′-ACCAACTTCCCTAACTTTCCT-3′,下游引物：5，-ACTATGGCTCGGTGCGAGAA-3′)、p21(上游引物：5′-GAGAACTCGGGACCGCTTTC-3′，下游引物：5′-TCCTGAGCGTGTTTGCTGTC-3′) mRNA水平，PCR反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，共42個循環；72℃ 5 min。GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt表示。

2 結果

2.1各組大鼠腦組織HE染色 腦梗死組大鼠腦組織水腫，腦細胞排列紊亂，細胞核仁模糊，小膠質細胞數量增多，腦梗死面積為20.13%；假手術組和正常對照組大鼠腦組織未見明顯異常。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色(×100)Fig.1 Morphology of brain tissue of rats in various groups (HE,×100)Note:A.Cerebral infarction group;B.Sham operation group;C.Normal control group.

2.2各組大鼠mNSS評分比較 腦梗死組大鼠建模后表現為右側轉圈障礙、右前爪不能伸展，表明腦梗死模型建立成功，死亡2只，存活13只；假手術組和正常對照組大鼠無異常表現，每組15只均存活。三組大鼠mNSS評分比較差異有統計學意義(F=397.354，P<0.001)，其中腦梗死組大鼠mNSS評分[(11.43±2.14)分]明顯高于假手術組[(0.45±0.07)分]和正常對照組[(0.43±0.09)分](P<0.05)，假手術組和正常對照組大鼠mNSS評分比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比較 腦梗死組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4蛋白水平高于假手術組和正常對照組(P<0.05)，p21蛋白水平低于假手術組和正常對照組(P<0.05)，假手術組和正常對照組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.4各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比較 腦梗死組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4 mRNA水平高于假手術組和正常對照組(P<0.05)，p21 mRNA水平低于假手術組和正常對照組(P<0.05)，假手術組和正常對照組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白水平比較

Tab.1 Levels of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue in various group rats

GroupsnProtein relative expressionGDF-15Smad2Smad4p21Cerebral infarction group130.54±0.230.63±0.210.77±0.260.23±0.06Sham operation group150.11±0.051)0.25±0.131)0.31±0.171)0.57±0.211)Normal control group150.12±0.041)0.23±0.121)0.32±0.151)0.55±0.191)F value 47.35628.58224.54216.993P value<0.001<0.001<0.001<0.001

Note：In comparison with cerebral infarction group,1)P<0.05.

表2 各組大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21 mRNA水平比較

Tab.2 mRNA levels of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue in various group rats

GroupsnGDF-15 mRNASmad2 mRNASmad4 mRNAp21 mRNACerebral infarction group130.73±0.181.54±0.361.42±0.410.63±0.11Sham operation group150.09±0.030.67±0.180.74±0.191.21±0.14Normal control group150.11±0.040.65±0.170.71±0.221.19±0.16F value170.02358.23027.421201.734P value<0.001<0.001<0.001<0.001

圖2 大鼠腦組織GDF-15、Smad2、Smad4、p21蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot results of GDF-15,Smad2,Smad4 and p21 in brain tissue of ratsNote:A.Cerebral infarction group;B.Sham operation group;C.Normal control group.

表3 腦梗死大鼠腦組織GDF-15蛋白水平與mNSS評分及Smad2、Smad4、p21蛋白水平的相關性

Tab.3 Correlation between GDF-15 level in brain tissue in cerebral infarction group rats,mNSS scores and levels of Smad2,Smad4 and p21

IndexGDF-15 proteinr valueP valuemNSS scores0.546<0.001Smad2 protein0.613<0.001Smad4 protein0.576<0.001p21 protein-0.523<0.001

表4 腦梗死大鼠腦組織GDF-15 mRNA水平與mNSS評分及Smad2、Smad4、p21 mRNA水平的相關性

Tab.4 Correlation between GDF-15 mRNA level in brain tissue in cerebral infarction group rats,mNSS scores and mRNA levels of Smad2,Smad4 and p21

IndexGDF-15 mRNAr valueP valuemNSS scores0.572<0.001Smad2 mRNA0.645<0.001Smad4 mRNA0.607<0.001p21 mRNA-0.512<0.001

2.5腦梗死大鼠腦組織GDF-15水平與mNSS評分及Smad2、Smad4、p21水平的相關性 腦梗死大鼠腦組織GDF-15蛋白水平與mNSS評分、Smad2蛋白、Smad4蛋白水平呈正相關(P<0.05)，與p21蛋白呈負相關(P<0.05)，腦組織GDF-15 mRNA水平與mNSS評分、Smad2 mRNA、Smad4 mRNA水平呈正相關(P<0.05)，與p21 mRNA呈負相關(P<0.05)。見表3、4。

3 討論

GDF-15是從人骨髓單核細胞系中分離出來的，其蛋白結構符合TGF-β超家族成員結構，因此GDF-15為TGF-β超家族成員之一，在生理情況下，GDF-15只有在前列腺、胎盤等少數組織中表達，在其他組織中不表達或表達量非常少[5,6]；GDF-15為一種應激蛋白，在腫瘤、心血管疾病、炎癥、外傷等各種應激狀態下，GDF-15表達量明顯增加[7]。GDF-15在心血管疾病中的研究比較多，血循環中GDF-15水平升高為多種心血管疾病(包括穩定性冠心病、急性冠狀動脈綜合征、心力衰竭等)發生心血管事件的高危因素[8-10]。GDF-15在腦血管疾病中的研究不多，盧昌均等[11]研究發現血清GDF-15水平與急性缺血性腦卒中關系密切；Andersson等[12]研究發現循環中GDF-15水平與腦損傷和腦中風關系密切。本文通過建立腦梗死大鼠模型，研究腦梗死大鼠腦組織中GDF-15表達情況，發現與假手術組和正常對照組大鼠比較，腦梗死大鼠腦子中GDF-15水平升高，GDF-15水平與神經功能缺損呈正相關，考慮GDF-15與腦梗死的發生關系密切。

Smad蛋白家族直接參與TGF-β超家族成員的信號傳導，是細胞內重要的信號轉導蛋白之一，Smad蛋白家族參與細胞分化、增殖、遷移、凋亡等多種細胞活動，在維持細胞內環境穩態中具有重要作用[13，14]；在機體受到損傷時，細胞釋放TGF-β，TGF-β與細胞表面受體結合正反饋引起其他TGF-β受體磷酸化，磷酸化的TGF-β受體激活Smad信號通路，并使細胞內的Smad2和Smad3磷酸化，并發生空間構象變化[15，16]，并與Smad4發生交聯，形成異三聚體復合物，異三聚體復合物進入細胞核，調控靶基因轉錄，從而促進炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等[17，18]。p21是受Smad4調控的靶基因，p21水平降低可促進細胞衰老和死亡，與細胞凋亡關系密切[19]。本文對GDF-15與Smad2、Smad4進行相關性研究，發現腦梗死大鼠腦組織Smad2、Smad4水平升高，p21水平降低，腦組織GDF-15水平與Smad2、Smad4水平呈正相關，與p21水平呈負相關，因此，考慮GDF-15對腦梗死神經功能的影響可能與Smad通路及其靶基因p21有關。