IFN-γ在早孕母胎界面對吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)表達的正性調節研究

涂媛媛 喻海芬 趙淑云 翁宇紅 王 珺 李仕祥 錢志瑤 黃官友

(貴州醫科大學附屬醫院,貴陽 550004)

胎兒如何逃脫母體免疫系統的攻擊，具體機制尚不明確。母胎界面由母體的蛻膜組織及胚胎的滋養細胞組成，胚胎作為半同種移植物不被母體排斥，與母胎界面的免疫耐受狀態相關。干擾素(interferon-γ，IFN-γ)由分泌蛋白質組成，存在于各種脊椎動物體內，具有抗病毒、抗細胞增殖、抗腫瘤、免疫調節等多種活性[1]。吲哚胺-2，3雙加氧酶(indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO)是沿犬尿酸途徑中分解代謝催化色氨酸的限速酶，存在于哺乳動物的組織與細胞中，在淋巴組織和胎盤中廣泛表達，正常狀態下呈低水平表達，在炎癥過程或感染中，IDO表達顯著增加，另外IFN-γ和脂多糖(lipopolysacch-arides，LPS)也可誘導IDO表達[2,3]。雌激素是一種性激素，對生殖發育至關重要，主要有三種類型：雌酮、雌二醇、雌三醇。當雌二醇水平逐漸升高約100倍時，雌三醇水平從早期妊娠到晚期妊娠增加約1 000倍，產后則急劇下降[4]。在懷孕期間，胎盤細胞產生性激素，特別是雌激素。雌激素在免疫系統中也有作用，但其機制尚不完全清楚。雌激素主要通過影響胸腺的T淋巴細胞、B淋巴細胞及細胞因子表達而調節免疫系統，此外雌激素還可促使自身免疫性B細胞增多而克服免疫耐受，通過改變細胞因子來誘導B細胞活化，降低B細胞凋亡。由于Th1型細胞因子參與急性同種移植排斥反應，Th2型細胞因子參與免疫耐受。傳統理論認為母胎界面中Th1/Th2的平衡向Th2偏倚有利于母胎免疫耐受，向Th1偏倚與復發性流產等密切相關。近年的研究表明，胚胎植入部位有包括IFN-γ在內的高水平的Th1型細胞因子[5,6]，而妊娠期有一個非常顯著的特征是胎盤組織通過產生大量的IDO來維持母胎耐受。在免疫微環境中，早期IDO的表達可能與IFN-γ有關，而晚期可能與TGF-β有關[7]。由于Th1型細胞因子參與急性同種移植排斥反應，Th2型細胞因子參與免疫耐受。傳統理論認為母胎界面中Th1/Th2的平衡向Th2偏倚有利于母胎免疫耐受，向Th1偏倚與復發性流產等密切相關[8-13]。本文分析早孕絨毛和脫膜組織中IFN-γ上調IDO表達的可能性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本 選擇2015年10月至2017年6月，在貴州醫科大學附屬醫院收治的接受人工流產治療的孕6～9周正常妊娠婦女38例及人工流產獲得的絨毛及蛻膜組織。納入標準：健康正常妊娠婦女；妊娠6～9周；妊娠期間未接受過藥物治療。排除標準：合并全身性疾病者；接受稽留流產或孕酮和米非司酮人流前處理者。研究經貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，且患者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑 細胞裂解緩沖液(RIPA)(BL502A)和蛋白酶抑制劑(P8340)均購自美國Sigma公司；一抗和二抗去除液(HCY055)、三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸電泳液粉劑(56-40-6)及BCA-100蛋白定量試劑盒(P0012)均購自碧云天公司(877-616-CELL2355)、(D3H2)XP?Rabbit mAb、10×TBST(T1081)、IFN-γ(877-616-cell 2355)和兔抗IDO抗體均(86630)購自美國Cell Signaling Technology公司；PVDF膜(IPVH00010PCRE)、ECL試劑(c_311032402_10)和HRP標記山羊抗兔IgG(M_25420100_10)均購自PerkinElmer公司；預染蛋白相對分子質量Marker(BL706A)和5×SDS-PACE蛋白上樣緩沖液(BL502A)均購自美國Biosharp公司；兔抗GAPDH抗體(A01020美國Gnne Tex公司)；SDS-PACE制備試劑盒(325OGR500)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1IFN-γ和IDO在早孕絨毛及蛻膜中的表達 用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌早孕絨毛和蛻膜殘留的紅細胞，取絨毛和蛻膜組織各100 mg，置于研缽并加入適量液氮，碾碎組織成粉末，加入蛋白酶抑制劑的裂解液充分裂解，置于4℃離心機，3 000 r/min離心30 min，取上清并采用BCA檢測蛋白濃度。加緩沖液煮沸變性，將變性的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，封閉，孵育一抗，4℃過夜，洗膜加二抗，孵育1 h，ECL顯影，圖片瀏覽軟件(Imagel J)處理圖片，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，IFN-γ和IDO的表達采用目的蛋白條帶與內參吸光度值的比值表示(標準：Western blot實驗得到的目的蛋白灰度值，除以GAPDH內參灰度值得到的目的蛋白的相對表達量)。

1.2.2Western blot檢測不同濃度IFN-γ培養對IDO蛋白表達的影響 無菌收集絨毛和蛻膜組織后，立即放入0.1 m無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline pH7.2，PBS pH7.2)中且15 min內在盒內運送到實驗室，然后用PBS洗滌去除紅細胞。在Western blot分析前，將組織標本保存在-80℃處，或切成小塊(濕重≤1 mg)進行培養。培養樣品在收集后40 min內進行處理。將小塊絨毛和蛻膜用F-12/DMEM(21041025加拿大Invitrogen公司)沖洗2次，離心5 min后，在培養基中加入10%FBS(10100147吉布科；澳大利亞)和1%青霉素，在37℃溫箱(美國Thermo公司)與5% CO2共同孵育。給予不同濃度的IFN-γ(1、10、100 ng/ml)分別以48 h、72 h培養胚胎絨毛組織與蛻膜組織，對照組用PBS水替代，Western blot檢測IDO在兩種組織中的表達情況。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件對實驗數據進行統計，t檢驗和雙變量的直線相關性分析IFN-γ和IDO在早孕絨毛及蛻膜組織中的表達等計量資料，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1IFN-γ、IDO在早孕絨毛及蛻膜組織中的表達及相關性 Western blot檢測顯示早孕絨毛組織和蛻膜組織中(圖1A)均可見分子量為46 kD和17 kD的蛋白條帶，與人的IDO和IFN-γ蛋白分子量大小一致，提示絨毛和蛻膜中均有IDO和IFN-γ的表達。分別對IDO、IFN-γ在兩種組織中的表達情況進行統計分析，結果顯示，IDO與IFN-γ蛋白在絨毛組織中呈正相關表達，如圖1B所示(r=0.987 1，P<0.05)；IDO與IFN-γ蛋白在脫膜組織中呈正相關表達，如圖1C所示(r=0.979 1，P<0.05)。分別以IDO、IFN-γ在絨毛組織與蛻膜組織中的表達量進行統計分析，如圖2，結果顯示，IDO在蛻膜組織中的表達高于在絨毛組織中的表達(P=0.002)；IFN-γ在蛻膜組織中的表達同樣高于在絨毛組織中的表達(P=0.001)。圖3為各數據匯總統計分析圖。

2.2IFN-γ誘導絨毛和蛻膜中IDO的表達 通過IFN-γ誘導絨毛和蛻膜中IDO的表達，以確定IFN-γ是否能影響IDO的表達。將絨毛和蛻膜分別切成小塊，孵育6 h，然后加入不同濃度(1、10、100 ng/ml)的IFN-γ，培養48 h和72 h后分別進行Westren blot分析，以檢測IDO的表達。根據IDO、IFN-γ擴增帶灰度值與GAPDH帶灰度值的比值進行統計分析，數據為平均值±Se,相關實驗結果重復3次后選取1例為文章示例圖。圖2、3表示在IFN-γ濃度分別為1、10、100 ng/ml時，對絨毛組織孵育48、72 h時， IDO表達情況與不同IFN-γ濃度之間的關系，P值分別為0.048、0.036，r值分別為0.952 1，0.964 1；圖4、5為IFN-γ濃度分別為1、10、100 ng/ml時，對蛻膜組織孵育48、72 h時，IDO表達情況與不同IFN-γ濃度之間的關系，P值分別為0.036、0.034，r值分別為0.964 1、0.966 4。結果顯示，在培養的絨毛和蛻膜組織中加入IFN-γ培養48 h及72 h后，IDO蛋白有較高表達，均高于對照組，且隨著IFN-γ濃度的升高而增加(圖2～5)。由此可知，IFN-γ可上調母胎界面中IDO的表達來維持免疫耐受。

圖1 IDO與IFN-γ在絨毛、蛻膜組織中的表達Fig.1 IDO and IFN-γ expression in chorionic villi and deciduaNote:Samples of Numbers 1-8.***.P<0.001,**.P<0.01,*.P<0.05.

圖2 絨毛組織中不同IFN-γ濃度48 h IDO的表達情況Fig.2 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured chorionic villi for 48 h

圖3 絨毛組織中不同IFN-γ濃度72 h IDO的表達情況Fig.3 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured chorionic villi for 72 h

圖4 蛻膜組織中不同IFN-γ濃度48 h IDO的表達情況Fig.4 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured decidua for 48 h

圖5 蛻膜組織中不同IFN-γ濃度72 h IDO的表達情況Fig.5 Expression of IDO with IFN-γ added in cultured decidua for 72 h

3 討論

本研究結果表明，在早孕絨毛和蛻膜組織中，IFN-γ和IDO的表達均呈正相關，提示在該組織中，IFN-γ上調IDO的可能性較大； 在培養的早孕絨毛和蛻膜組織中加入不同濃度的IFN-γ，發現所加入的IFN-γ的濃度與IDO的表達均呈正相關，揭示在早孕絨毛和蛻膜組織中，IFN-γ上調IDO的表達。Kudo等[14]曾報道在培養的人胎盤絨毛組織中加入不同濃度的IFN-γ，發現所加入的IFN-γ的濃度與IDO mRNA的表達呈劑量依賴關系，但該文的研究僅限于mRNA水平，且僅限于細胞培養(只研究培養的胎盤絨毛，未研究蛻膜組織)，并沒有報道未培養的早孕絨毛和蛻膜組織中IFN-γ和IDO的表達的關系。我們在Kudo 等報道的基礎上做了進一步的研究。本研究結果表明，不僅僅是絨毛組織，蛻膜組織亦可通過IFN-γ上調IDO的表達來致免疫耐受。

IFN-γ誘導的一氧化氮敏感性效應機制有可能是誘導IDO的作用機制之一[15，16]。IFN-γ的抗衣原體活性超越色氨酸耗竭，包括干擾細胞能量代謝，導致后代減少，但也降低了細胞的抗菌敏感性[17]。IFN-γ通過信號轉導和轉錄激活因子1的激活，顯著增加IDO的表達[18]。IFN-γ能顯著激活角質形成細胞的IDO表達，而非成纖維細胞[19]。Sakural等[20]發現IFN-γ在實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎發病的臨床前期達到高峰，緩解期降低。而IDO的升高在時相上正好在IFN-γ之后。IFN-γ誘導IDO表達的特點是表達強度較高及表達持續的時間較為短暫。因而，IFN-γ誘導IDO的表達有助于宿主限制微生物的生長及預防急性炎癥對宿主潛在的損害，但IFN-γ誘導IDO表達的特點不能解釋IDO在體內的長期效應，即維持包括妊娠和自身耐受等免疫穩態[2]。

眾所周知，母胎界面有Th1 型細胞因子和Th2 型細胞因子。Th1 型細胞因子包括IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-2及IL-12。Th2型細胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-6 及IL-10。正常情況下,母胎界面的細胞因子向Th2 型偏倚，即母胎界面Th2 型細胞因子較Th1 型細胞因子占優勢[21]。傳統認為，受孕后，母體對胎兒的識別及妊娠的維持是通過占優勢的Th2 型細胞因子來實現的，母胎界面的Th2 型細胞因子是維持同種異體耐受的核心，Th2 型偏倚的重要意義在于維持妊娠和抑制母體和胎兒之間的排斥反應，即維持母胎耐受[22，23]。我們的研究結果提示，Th1 型細胞因子(IFN-γ)亦可通過調節IDO的表達致母胎耐受，從而保護胎兒免受母體的排斥。因而，本研究進一步完善了母胎耐受的機制。

總之，本研究發現早孕絨毛和蛻膜組織中IFN-γ和IDO的表達呈正相關，并在體外培養的該組織中發現IFN-γ可上調IDO的表達。本研究結果表明，在早孕母胎界面IFN-γ可通過上調IDO的表達來致母胎耐受。