微生物次級代謝產物生物合成的研究進展

趙江華 房歡 張大偉

（1.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308；2.河北農業大學食品科技學院，保定071000）

微生物包括細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內的一大類生物群體，它個體微小，與人類關系密切。其涵蓋了有益和有害的眾多種類，廣泛涉及食品、醫藥、工農業、環保和體育等諸多領域。在我國教科書中，將微生物劃分為以下8大類：細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體和螺旋體。在上述8類微生物中，能夠產生與我們生活息息相關的次級代謝產物的主要是細菌、真菌和放線菌。

生物從環境中攝取小分子營養物質，合成氨基酸、蛋白質、核酸等生命活動必須的物質以及獲取能量的過程稱為初級代謝［1］。除了初級代謝外，微生物還能通過次級代謝活動分泌多種次級代謝產物，如維生素等具有重要價值的活性物質。不同于初級代謝，次級代謝通常由營養物質、生長速度、反饋控制、酶失活和誘導等因素控制，并非生命體必須進行的活動。但兩者并不是毫無聯系，它們之間互相作用，共同調節生命活動。初級代謝是生命活動的基礎，其產物可作為次級代謝的原料，次級代謝產物如抗生素能夠抑制其他微生物的生長，所以次級代謝能夠調節初級代謝活動［2］。常見的次級代謝產物有抗生素、激素、毒素、生物堿及維生素等［3］。

1 次級代謝產物的來源

1.1 細菌來源次級代謝產物

除了植物，細菌占了地球上生物量的大部分。它們隨處可見，盡管某些物種只在特定的生態位中繁衍生息［4］。長期以來，細菌發酵一直被用于制造具有營養、農化和醫藥價值的天然產品。如黏細菌，它產生的次級代謝產物無論是在化學結構還是生物活性上都具有豐富的多樣性。代謝產物的多樣性及廣譜活性，在開發藥物方面具有巨大的潛力。黏細菌的抗生素產生菌的比例高于目前已知的產生抗生素最多的放線菌［5］。

1.2 真菌來源次級代謝產物

真菌具有生物多樣性，已描述的真菌種類約 9.7萬余種，僅占 6%左右?，F今已知的具有生物活性的微生物次級代謝產物中，有50%是絲狀真菌產生的［6］。包括人們最熟悉的青霉素和頭孢菌素等抗生素、免疫抑制劑環孢菌素A、降血糖藥物阿卡波糖以及降血脂藥物洛伐他汀等。此外，真菌還能夠產生大量的細胞毒物質，其中包括一些強毒性化合物，如單端多孢霉烯以及黃曲霉毒素等真菌毒素［7］。眾所周知，黃曲霉毒素能夠致癌，嚴重威脅人類的生命健康，但是人類可以通過研究其致癌機理，發現潛在的抗腫瘤藥物。如具細胞毒活性的二酮哌嗪類化合物可作為治療腫瘤的藥物［8］。

1.3 放線菌來源次級代謝產物

微生物產生的具有生物活性的天然次級代謝產物，大都基于對放線菌的挖掘。放線菌次級代謝產物種類豐富，約占已報道微生物來源生物活性物質的50% 左右，這些物質根據化學結構可分為 β-內酰胺類、多肽類、糖肽類、核苷類及聚酮類等［9］，具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、殺蟲及免疫抑制劑和免疫激活劑等的功效，在醫藥業、農業、獸業、食品工業等領域有廣泛地應用［10］。

雖然對次級代謝產物的產生菌已經進行了多方面的挖掘，但迄今為止我們發現的數量只是冰山一角，況且利用傳統的辦法已經很難發現新的產物，在提高產物產量方面也遇到了瓶頸。有兩個因素阻礙了新化合物面世：（1）能夠在人工培養條件下存活的微生物為數不多，目前在實驗室培養條件下成功的僅占0.1%-1%［11］；（2）在普通培養條件下，大多數次級代謝產物生物合成基因簇（BGCs）不能表達。如果這些潛在的生物合成開關被打開，就有望發現更多新的活性產物，新藥研發會有一個跳躍式發展［12］。

2 研究微生物次級代謝產物應用到的方法策略

2.1 次級代謝產物生物合成基因簇異源表達

阻礙次級代謝產物出現的因素之一就是標準實驗室生長條件，因此微生物代謝組尚有很大的開發空間［13］。2018年，Harvey等［14］開發了異源表達合成生物學平臺，用于釀酒酵母中真菌生物合成基因及其編碼代謝物的快速、可擴展表達。通過高通量基因組測序，對潛在的次級代謝產物合成途徑有了一定認識。通過異源表達途徑重建與基因工程相結合，可以發現新的化合物，闡明產物合成途徑，優化產品產量。大腸桿菌、酵母菌、絲狀真菌作為模式菌株，有完善的遺傳工具箱，是高效的異源宿主［15］。在Harvey等［14］的研究中，將41個不同來源的BGC在釀酒酵母中表達，其中22個（54%）來自不同的子囊菌和擔子菌，產生了可檢測的非釀酒酵母特有的化合物。這個平臺使酵母的異源表達方法向前邁進了一大步，并可能為發現許多天然產物打開大門。通過異源表達，可以更清楚的了解產物的代謝過程，為產物產量的優化和獲取更加有價值的次級代謝產物指明了方向［16］，其優點主要包括：（1）繞過了難以培養或無法培養的菌株；（2）將每種BGCs與其產生的次級代謝產物掛鉤；（3）有利于對宿主進行基因操作、優化后期的發酵條件，實現工業化生產［17］。

2.1.1 宿主細胞遺傳修飾和改造 異源沉默基因簇表達時，為防止宿主環境不適合外源基因的表達，有必要對宿主進行遺傳修飾改造［18］。和公司裁員大概是一個道理，對基因組進行刪減，就像是給細胞減負，這樣才能達到特定次級代謝產物的生物合成水平。本身的基因對外源基因簇的影響降低，可為沉默基因簇的表達提供理想條件［19］。當大腸桿菌或酵母用作真核生物次級代謝產物生物合成基因的表達宿主時，為防止宿主元件的缺失，需要對宿主菌株進行工程設計，以產生 4-磷酸泛乙烯基轉移酶（PPTase），特別是 PKSs 和 NRPSs 的表達。絲狀真菌宿主具有內源性 PPTase 活性，為PKSs 和NRPSs的ACP和PCP結構域提供修復基，因此它們不需要外源性PPTase基因［15］。

2.1.2 對基因簇的加倍和其他調控 在對卡那霉素高產菌株的研究中，工作人員發現多拷貝的卡那霉素基因簇，這種多拷貝的方法是提高產量的有效手段［20］。除了基因簇加倍，還可以采取轉座子干擾、紫外線或化學誘變或單基因缺失文庫的手段，用BGC刪除策略構建基因缺失文庫，然后研究這個敲除文庫中的代謝圖譜。還有敲除抑制次級代謝產物表達的基因、過度表達簇特異性轉錄激活因子或全局性調控因子［15］、組成型表達或過表達同源正調控基因［21］等這些途徑都有助于發現更隱秘或沉默的次級代謝物。

2.1.3 宿主細胞與生物合成基因簇適配性改造 絲狀真菌的異源表達具有一定的挑戰性，寄主可能受到插入簇的影響，導致代謝物譜發生變化，或插入簇與原簇之間產生串擾，從而難以識別正確的新次級代謝產物。為了使異源簇表達，通常將內源次級代謝產物BGCs沉默，或將其敲除或抑制其表達。但是，這一舉措會使異源簇與宿主不適配的問題更突出，通常不能產生理想的產物或產量很低。主要原因是基因簇未正常轉錄，直接過表達關鍵基因、更換活性適當的啟動子，可精細調控關鍵基因轉錄量使基因簇正常表達。也可引入供體基因增加前體。此外，異源表達過程中有時不會正確利用底物，引起資源浪費，限制合成能力，導致產量降低。引入糾錯因子可以阻斷宿主細胞中的某些基因編碼酶對異源次級代謝產物的錯誤修飾，可使產物復性［22］。

2.2 轉錄、翻譯水平進行調控

2.2.1 核糖體工程 野生型變鉛青鏈霉菌在正常情況下不會生產抗生素，但是當環境因素改變導致其核糖體蛋白S12突變后，便能生產大量藍色的放線紫紅素［23］。通過調節核糖體蛋白或rRNA可以顯著改變細菌基因表達，最終導致不活躍（沉默）基因的激活。因此，我們的最終目的是開發“核糖體工程”，以合理的方法充分激發細菌的能力。Ochi研究組［24］引出了核糖體工程的概念：微生物在資源耗盡時會產生突變，形成耐藥性菌株。該菌株核糖體或RNA聚合酶改變，會影響蛋白的表達，最終的影響是出現新的代謝產物或者原有代謝物的分泌量提高。核糖體和 RNA 聚合酶是蛋白質合成過程中的兩個重要部分，如果它們發生了突變將會對次生代謝物的合成帶來深刻的影響［25］。劉華華等［26］通過核糖體工程技術成功篩選獲得一株耐鏈霉素的阿維拉霉素高產突變菌株S.viridochromogenes gs 77-54，而且對其遺傳穩定性能進行測驗，結果表現出很好地穩定性。

2.2.2 干擾蛋白質降解系統 催化反應的蛋白包括一些轉錄因子不能持續發揮作用，它們都會經蛋白酶途徑失活，這一過程依賴泛素標記的靶蛋白，需要多蛋白COP9信號復合物。Jennifer等［27］將構巢曲霉作為研究對象，敲除編碼COP9第5亞基的csnE基因，對突變體的次級代謝產物進行了研究。研究結果顯示：有聚酮合成酶的基因被激活并且產生了它的代謝產物DHMBA，除此之外還從突變菌株中發現了苔色酸。實驗表明，敲除蛋白失活過程中編碼關鍵蛋白的基因可以阻斷代謝過程中蛋白質的降解，可以激活沉默的基因表達。通過他們的實驗可以預見，還有更多新的沉默基因以及次級代謝產物有待發現［28］。

2.2.3 轉錄因子的調控 鏈霉菌產生氣生菌絲體和次級代謝產物的過程由微妙而精確的監管系統控制。與真菌一樣，細菌代謝過程中最常見的是在轉錄起始水平的調節，在這一過程中，起主要作用的是轉錄因子，它們通過結合DNA上特殊的序列來抑制或激活特定基因的轉錄［29］。轉錄因子對基因轉錄的起始進行調控，按照調控作用劃分，轉錄因子可分為正調控因子和負調控因子。正調控因子對基因簇的轉錄起到促進作用，而負調控因子是相關基因簇的“絆腳石”，使基因簇關閉［30］。為了研究 HOS2型酶在曲霉中的作用，Angelo等［31］刪除了 HosA 的編碼序列。將具有缺失結構的單一基因組整合的hosA缺失菌株的孢子接種到瓊脂平板上，并將分別裝載有濃度增加的抗真菌物質的條帶施加到平板上。結果顯示，HosA 缺失菌株在瓊脂平板上和液體培養中有顯著的色素沉著，表明 HosA 可能作為次級代謝產物的阻遏物。為了證明 HosA 在 烯酸（OA）生物合成基因簇調控中的作用，研究人員將 HosA 缺失株培養 24、36、48 和 60 h，用 RNA 雜交探針對烯酸生物合成基因簇聚酮合酶基因 orsA 進行 Northern雜交分析。結果表明HosA 活性抑制烯酸生物合成。但是，與烯酸相比，hosA 缺失對 青霉素（PN）產生顯著而相反的結果。因此，轉錄調控因子也是一種常用的抑制或激活次級代謝產物的策略。

2.3 表觀遺傳調控

在DNA 序列不變的情況下改變基因表達或使其沉默，這種策略稱表觀遺傳調控。由于真核生物具有染色體結構，染色質纏繞而導致生物合成基因簇處于沉默狀態，通過打開染色體的螺旋結構，使染色質處于“蓬松”狀態，進而解除生物合成基因簇的“沉默禁令”。LaeA就通過染色體重塑解除沉默禁令的信號。LaeA攜帶S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）結合域，SAM結構域識別甲基轉移酶的特征，將甲基從普遍存在的SAM轉移到氮原子、氧原子或碳原子。這種反應經常用于所有門的生物體中，不僅修飾蛋白質，還修飾DNA、RNA和小分子。作為一種全局性調控因子，LaeA廣泛存在于絲狀真菌中。除了采用分子遺傳學手段控制LaeA的表達，目前經常使用抑制劑抑制表觀遺傳修飾酶的表達［32］。Willams等［33］利用化學表觀遺傳學方法，在枝孢菌的培養中加入5-氮胞苷，進而得到氧化脂質。Henrikson 等［34］在黑曲霉的發酵過程中添加脫乙酰酶抑制劑SAHA，意外獲得了新的化合物 nygerone A。對黑曲霉進行研究發現，36%的黑曲霉BGCs的轉錄被脫乙酰酶抑制劑SAHA顯著上調，說明染色質重塑在激活沉默基因簇中的潛力［35］。

2.4 代謝調控技術

代謝調控就是通過對DNA進行有目的改造，對體內的代謝網絡進行精密調控，實現菌體性能的提高、其他大分子裝配等的過程。為提高鏈霉菌中聚酮類化合物的效價，研究人員設計了一個動態降解三酰甘油（ddTAG）的策略，來高效利用三酰甘油以增加聚酮的生物合成。將sco6196基因置于cumate誘導啟動子的控制下，以生成ddTAG模塊，從而能夠選擇性地控制TAG降解的時間和強度。將ddTAG質粒轉化到M145以產生菌株M145-DT，發現使用誘導劑調節TAG降解可增加放線菌素的效價。對這一現象的合理解釋是TAG的合理流通可以提供并將更多的碳通量轉向放線菌素合成。ddTAG的應用使阿維菌素B1a在工業規模發酵中的效價提高了50%，達到9.31 g/L［36］。在鏈霉菌中，脂肪酸和聚酮類化合物的合成共用前體乙酰CoA，因此會發生底物的競爭。有研究表明，在鏈霉菌中有兩種中心碳代謝酶通過復制被擴增，它們分別是磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，并且對著兩種酶進行詳細的遺傳和生化分析，發現這兩種酶的缺失突變體表現出抗生素生產過剩的表型。這表明初級代謝的精細平衡受到干擾會影響前體的供應和應激反應。因此，通過代謝干擾可增強主要代謝底物的供應，脂肪酸生物合成的抑制被作為一種促進聚酮類次級代謝產物合成的途徑［37］。上述兩個例子，都是通過調控代謝過程，改變了碳的流通，將碳源集中分配，在保證不破壞其他關鍵途徑的前提下，以提高目標產物產量為最終目標。

2.5 調整培養條件

微生物易受培養條件的影響，如培養基組成、溫度、pH 值、金屬離子、氧氣濃度、鹽度、培養狀態、生物合成前體等，這些因素的調整必定會引起酶活性的改變，可能導致與之相關的次級代謝物多樣性的改變。因此在微生物賴以生存的培養基上進行研究，就能產生新類型的次級代謝產物的出現或者已知次級代謝產物產量增加的結果。一株海洋衍生菌株 Ascotricha sp.ZJ-M-5 在由海鹽組成的富營養化培養基中培養時，發現產生了一種新的三萜類化合物（119）和一種新的環烯醚衍生物（120）。然而，在改良的 Czapek-Dox 培養基中檢測到3種新的石竹烯衍生物（121-123），而在沒有 Mg2+的發酵液中沒有化合物122［38］。這種方法相對經濟簡單但結果卻有多種可能，起到的是“牽一發動全身”的作用，不能確定因某一條件的改變引起的基因簇的變化，盲目性強。因此對后面比較分析代謝譜造成困難，對基因組信息有缺漏或沒有測序的次生代謝產物的發現有幫助。低濃度抗生素、信號分子的添加［39］也是從這種方法中衍生出來的。

2.6 微生物共培養

在一種培養基中，一個菌株與另一個菌株之間的關系可能是競爭性的、對抗性的或友好的。兩個或兩個以上菌株的共培養通常對提高已知化合物的產量或積累在無菌培養中未檢測到的隱匿化合物具有積極作用。土壤放線菌 S.coelicolor 與珊瑚球菌共培養時，可顯著提高紅色化合物十一肽的產量。一株陸地細菌Tsukamurella pulmonis TP-B0596 與一株鏈霉菌 NZ-6 共培養，刺激了3種前所未有的雙環和三環大內酰胺的新代謝物的產生。兩種海綿源放線菌Nocardiopsis sp.RV163和放線菌EG49 的共培養，誘導了10種化合物，包括二酮哌嗪、安古霉素和β-卡波林衍生物，而在單一培養中僅分離出3種天然產物。一種真菌菌株土曲霉與銅綠假單胞菌共培養時，可產生兩種新的莽草酸類似物和4種新的丁烯內酯衍生物，而這些化合物均未在無菌培養基中被發現［38］。微生物為了有限的資源，如空間或營養物而相互競爭。某些細菌可產生對其他微生物有毒的分子，使自己具有競爭優勢。這些有毒分子通常被稱為抗生素，然而，一些細菌可利用抗生素作為化學信號來調節它們的活動進而產生其他類型的產物［40］。雖然這種方法有效，但是同OSMAC策略一樣也具有一定的盲目性，兩株菌相互作用，其應激反應產生的物質作用在彼此身上并且體現在最后的產物上，我們不能摸清楚是哪種分子發揮作用。

3 結語

微生物次級代謝產物在農業、食品和醫療等領域有著廣泛的應用，具有很大的商業價值，因此提高次級代謝產物的產量將會創造巨大的經濟價值，挖掘新的次級代謝產物也會對新藥的開發起到極大的推動作用。生物學的發展，既豐富了我們的理論依據，也為我們帶來了新技術和新工具，微生物基因組測序和相關的生物信息工具的發展讓我們看到了挖掘新的次級代謝產物的前景。若這些沉默的基因簇全部被激活，次級代謝產物的數量將會以指數形式進行增長。上述挖掘新的次級代謝產物、提高微生物次級代謝產物的產量的策略中，歸根結底都是為了激活沉默的微生物次級代謝產物BGCs。只不過有的方法起到的是全域性調節，有的方法是針對具體的基因進行調控。近來，代謝組學迅速發展，我們對微生物體內的代謝網絡認識的越來越清楚。了解從初級代謝到次級代謝的轉變可以幫助制定策略，通過調控代謝過程使資源更多、更集中的流向目標產物。未來可以將傳統的代謝工程技術與更復雜的合成代謝工程相結合，運用系統生物學和進化工程可極大地促進所需和有價值的代謝物的產生。基因組測序和DNA合成成本的降低，以及用于BGCs克隆和重構的許多有效遺傳工具出現，基因編輯技術迅速崛起，CRISPR-Cas9系統正在成為一個新興的基因組編輯平臺，結合生物信息學、合成生物學、代謝組學等技術，通過對細胞內代謝網絡的深刻認識，相信微生物次級代謝產物BGCs的挖掘在后基因組時期將會進入一個黃金時代。