適合流式細胞儀分析的大豆細胞核解離液的篩選與應用

陳林 潘貞志 戴毅 宋麗

（1.揚州大學農業科技發展研究院 教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，揚州 225009；2.揚州大學生物科學與技術學院，揚州 225009）

流式細胞術是應用流式細胞儀對處于液流中的單個細胞或生物顆粒進行多參數、快速分析定量及分選的方法。隨著熒光分子標記技術的發展，流式細胞檢測廣泛的應用在生命科學領域：如通過流式細胞術來分析細胞的各種代謝特征，判斷細胞凋亡和細胞壞死［1-2］，評估細胞的分化和增殖特性［3］，以及DNA含量分析、細胞群比例的測定和分選［4］。流式細胞檢測在植物學研究中的應用主要有以下幾個方面：（1）植物細胞核分析，如：測定DNA的含量［5］、進行植物遺傳倍性分析［6］、細胞周期分析、測定基因組大小［7-8］；（2）染色體分析及分選和構建染色體文庫［9-10］；（3）原生質體和細胞融合產物分析及分選［11］；（4）應用在系統生物學和生態學上［12］。

然而，與動物細胞或醫學研究領域不同，植物細胞具有堅韌的細胞壁，細胞成分如多酚等大量富集，難以分離得到用于流式檢測的單細胞懸液。因此，為了對植物材料中核DNA進行定性及定量分析，目前主要采取兩種策略［13］：一種策略是酶解去除植物細胞的細胞壁從而收獲原生質體，原生質體在低滲溶液中吸水破裂進一步分離細胞核；另一策略是在合適的緩沖液中，通過物理機械切割植物材料使植物細胞破裂，從而使細胞核釋放到緩沖液中。Galbraith等［14］最早提出建立機械切割的方法并通過Galbraith’s核解離液成功測定了數種植物的DNA含量和細胞周期。Lee 等［15］改良MgSO4緩沖液成分并使核提取液通過一個棉柱，去除多酚類和細胞碎片，可從蘭花中可分離出完整的細胞核用于流式檢測；Loureiro等［16］采用GPB和WPB緩沖液制備了37種不同葉組織結構和化學成分的草本和木本植物標本，采用流式細胞儀分析其細胞核DNA含量；李思璐［17］通過流式細胞檢測MgSO4緩沖液制備的核懸浮液，研究不同逆境脅迫下玉米不同組織器官在各個發育時期內核復制的發生規律；張琳琳等［18］分別在Otto和LB01緩沖液中解離出細胞核并利用流式細胞術首次測定藥用植物黃芩的基因組大小；劉鳳霞等［19］從5種緩沖液中篩選出適合通過機械切割制備完整的梨葉片的細胞核懸浮液的核解離液。

大豆是我國重要的糧油作物，然而近年來干旱或洪澇災害發生頻繁，嚴重影響了其生產發展。大豆根系發育愈好，受水分脅迫危害的程度就愈小，抗逆性越強。因此，深入挖掘逆境下大豆根系發育的調控機理，對減輕干旱或澇漬威脅、保障大豆安全生產具有重要的現實意義［20］。植物根系的生長發育離不開細胞的分裂和分化，無論是根原基的起始與分裂，還是分生組織的形成和活化，都涉及到細胞周期中的細胞分裂和細胞生長兩個交替循環的過程［21-22］。此外，植物中一些細胞由于發育和/或環境因素的影響會在S期后跳過G2和M期直接回到G1期，再次起始DNA復制，如此循環導致形成多倍體的細胞［23-24］。因此研究細胞周期調控的機理不僅可以闡明植物生長發育的分子機制，也有利于闡明脅迫對作物生長影響的機制。

本研究在參考流式細胞術在其它植物物種檢測DNA含量的研究基礎上，尋找適合不同大豆品種的葉片及根組織的細胞核解離液及完善植物流式細胞分析方法及細胞核的制備方法，并利用該技術對PEG模擬的干旱脅迫下大豆根尖中細胞周期的調控進行了分析，為今后使用流式細胞儀對測定大豆DNA的含量、細胞比例和遺傳倍性、細胞周期的調控研究提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為大豆品種包括William 82、Holladay、PI 567611、PI 567651、Fiskeby III，由揚州大學大豆遺傳育種實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 植物細胞核解離液配制 本實驗所用6種核解離液配方見表1。

1.2.2 PEG 6000模擬干旱處理 大豆種子經吸水膨脹后種植在土壤中，萌發生長6 d，選擇生長狀態一致的豆苗，避免損傷大豆根系的前提下洗凈塵土，根系分別浸沒在濃度分別為0%和20% PEG 6000溶液中脅迫7 d后，將根系殘余的PEG 6000洗滌干凈，取2 cm左右的幼嫩根尖用于細胞核懸浮液制備。

1.2.3 細胞核懸浮液制備 取新鮮幼嫩的大豆葉片或根組織，蒸餾水洗凈表面塵土并用濾紙吸干殘余水分。培養皿置冰上預冷，加入5 mL預冷細胞核解離液，將植物材料浸沒在解離液中，用鋒利的刀片一次性快速切割植物材料。輕微的吹吸核解離液，但避免產生氣泡，以減少釋放的細胞核粘連在植物組織上，細胞核解離液經400目細胞濾器過濾，濾液放置于4℃或者冰上孵育5 min。濾液于4℃、1 000 r/min離心1 min，小心移去上清，沉淀經適量體積的新鮮的細胞核解離液重懸，經終濃度為4 μg/mL的DAPI染色10 min至60 min。

表1 核解離緩沖液配方

1.2.4 流式細胞儀分析 取制備好的細胞核懸浮液500 μL，用FACS LSRFortessa流式細胞分析儀（BD公司，美國）在低流速條件下檢測，至少吸取10 000 個經DAPI染色的顆粒。用Modfit 5.0軟件分析結果，分別畫出吸收的顆粒數（count）和熒光強度（Fluorescence intensity，FL）關系圖，所有樣品運行參數設置一致，測定參數主要有相對熒光強度、變異系數（Coefficient variation，CV）、碎片背景（Debris background factor，DF）。

2 結果

2.1 不同核解離液對細胞核解離的影響

本研究共采用6種不同核解離液分離大豆葉片細胞的細胞核。經流式檢測分析發現，根據散射光檢測信號，Galbraith’s核解離液（圖1-A）、LB01核解離液（圖1-B）、和mG核解離液（圖1-C）可獲得清晰的2團細胞器顆粒信號聚集區域，而Tris·MgCl2核解離液（圖1-D）、GPB核解離液（圖1-E）和WPB（圖1-F）核解離液中僅有一團細胞顆粒信號富集區域。通過對比大豆根中細胞核散射光信號，確認黑色框選中區域的信號對應為細胞核的散射光信號，推測在黑色框以外區域的信號富集可能為葉綠體細胞器。

2.2 不同解離液對DNA相對含量的影響

為了進一步確定適合大豆幼嫩葉片細胞核提取的核解離液，實驗結果用Modfit5.0軟件，以熒光面積信號為橫軸，以細胞核顆粒數為縱軸，根據所選定的信號區域顯示統計結果。通過DNA相對含量直方圖（圖2）可以得出：在Galbraith’s核解離液（圖2-A）、mG核解離液（圖2-B）和LB01核解離液（圖2-C）提取的細胞核懸浮液在G0/G1期均形成了呈正態分布的DNA峰，并且其變異系數CV均小于5%，分別是2.78%、4.24%和2.96%。但是Galbraith’s核解離液和mG核解離液中多倍體檢測到的量較少，在G2/M期未形成較明顯的峰，這有可能對DNA倍性和細胞周期以及有絲分裂各時期細胞數量的分析造成一定的誤差。LB01核解離液可檢測到顯著的G2/M期峰，雖然LB01解離液所形成的碎片較Galbraith's核解離液和mG核解離液多，但是在檢測細胞周期及遺傳倍性中相對更好。相反，GPB核解離液（圖2-E）和WPB核解離液（圖2-F）中DNA峰較差，碎片很多，其變異系數較大。Tris·MgCl2核解離液（圖2-D）可以形成呈正態分布的DNA峰，但DNA峰與另外由5種核解離液所得的DNA峰在熒光強度上，明顯相對減小且偏移較大，表明Tris·MgCl2核解離液可能對核內染色質的分布造成了影響。

進一步利用Galbraith’s核解離液（圖3-A）和LB01 核解離液（圖3-B）對大豆根中的細胞核進行了解離，研究結果表明兩種核解離液均在G0/G1期和G2/M 期均形成了呈正態分布的DNA峰。綜上所述，Galbraith’s和 LB01 核解離液適用于大豆葉和根中細胞核的解離。

圖1 不同核解離液處理獲得的大豆嫩葉組織細胞核散射光特征

2.3 不同核解離液對細胞核提取效率的比較

用Galbraith’s和LB01兩種不同核解離液提取的懸浮液細胞核形態觀察結果見圖3。結果表明這兩種核解離液不但可獲得較多的單個細胞核，而且細胞核呈飽滿的圓形或者橢圓形懸浮在核解離液中，較好辨認。因此這兩種核解離液能較好保證完整的細胞核從細胞中釋放出來，同時可以減少細胞中的次生代謝物的游離，盡管也有少量的幾個單顆粒細胞核黏在一起或者與其他雜質黏在一起的情況發生。

對比6種核解離液產生的細胞碎片發現，WPB和GPB核解離液中碎片較多，其中GPB核解離液不能分離出完整的細胞核，且細胞核的形態不完整，導致熒光信號不能聚集。因此這兩種核解離液不適合分離大豆細胞核。其中Tris·MgCl2核解離液中葉綠體的污染較少，但是細胞碎片較多。WPB、GPB以及Tris·MgCl2核解離液流速較慢，單位時間內顆粒數較少，也表明這3種核解離液不能高效的分離細胞核。

2.4 LB01核解離液在不同大豆品種上的適用性及應用性

為驗證LB01解離液是否具有廣適性，首先分別取大豆不同品種Holladay、PI 567611、PI 567651、FiskebyIII新鮮幼嫩的根尖，在LB01核解離液中機械切割釋放出細胞核，通過流式細胞儀檢測其DNA含量并分析遺傳倍性，結果如圖4所示。細胞核懸浮液在G0/G1期和G2/M期均形成了呈正態分布的DNA峰，并且其變異系數CV均小于5%。因此，LB01核解離液在其他大豆品種上亦具有良好的適用性。盡管不同大豆品種的細胞核的散射光特征上存在微小差異，可能是由于細胞核在顆粒大小及復雜程度上存在細微差異。

為進一步分析LB01解離液和流式細胞儀在大豆細胞周期檢測上的應用，我們同時檢測了PEG6000模擬干旱處理對不同大豆品種根尖的細胞周期的調控。結果（圖4）表明20% PEG6000處理使G2/M細胞比例相對增多，顯著促進核內復制。同時我們發現不同品種大豆對相同濃度PEG脅迫響應程度不同，例如PI 567651根尖的G2/M期細胞比例未處理為16.17%，處理后為63.22%，說明細胞周期被顯著阻滯（圖4-E-F）；但是PI 567611中根尖的G2/M期細胞比例未處理為24.36%，處理后的29.24%，雖然細胞周期被抑制，但是其響應PEG脅迫程度較其它品種低（圖4-C-D）。該研究結果不僅表明利用LB01核解離液和流式細胞術可成功檢測大豆根尖的細胞周期，而且表明干旱脅迫參與調控大豆根尖的細胞周期進程，及不同大豆品種響應程度有差異。

圖2 不同核解離液獲得的大豆嫩葉組織細胞核DNA相對含量

圖3 不同核解離液獲得的大豆根細胞核DNA相對含量及形態學觀察

3 討論

田新民等［25］建議選取適合實驗材料的解離液時可參照成功測定同屬或同科的物種的解離液，因此本研究為將來研究豆科植物利用流式細胞儀技術上提供參考。此外，由于流式細胞檢測需要在短時間內分析大量的細胞核懸液，因此對提取的細胞核懸液的純度和濃度要求較高，濃度為1×105-1×107個/mL的高純度完整的單顆粒細胞核較為適宜［26］。本實驗中由于葉綠體DNA可與染料DAPI結合，在分選時出現熒光值而干擾細胞核信號，而根組織中沒有葉綠體，由其制備的細胞核懸液的純度和濃度更高。因此，葉片組織和根組織相比，根組織是更適合流式細胞儀分選的材料。

核解離液中添加非離子型表面活性劑（如Tween-20或Triton X-100）可以促進細胞核的釋放及防止黏性物質粘住細胞核。本研究中所有的核解離液均添加了一定濃度的Triton X-100，但是提取細胞核的效果有差異。在所有的細胞核解離液，Galbraith’s解離液的解離效果最好，其Triton X-100濃度是0.1%，而WPB和GPB中，Triton X-100 濃度較高（0.5%-1%），核解離液中Triton X-100 的濃度可能是關鍵因素之一。此外，離心強度過大或時間過短，細胞核仍懸浮在核解離液中達不到富集的效果，在下一步棄多余核解離液而丟失；離心強度過大或時間過長，制備的細胞核懸浮液雜質會明顯增加甚至干擾檢測。

圖4 不同大豆品種在PEG模擬干旱脅迫前后細胞周期的分析

核內復制有助于維持植物在壓力條件下的生長以適應不利的環境因素。在許多物種中，水分脅迫可以通過降低細胞周期蛋白依賴性激酶的活性來抑制有絲分裂周期，增加核內復制周期。細胞核內復制水平的提高可促進細胞擴張，從而減輕水分虧缺對細胞大小的影響，幫助植物減緩所受到的脅迫傷害［27-28］。本研究在篩選適合大豆組織的核解離液的基礎上，進一步對大豆干旱脅迫下細胞周期的調控進行了初步分析，本實驗采用LB01核解離液提取的細胞核懸浮液的變異系數均小于5%，且碎片較少，主峰非常明顯，說明該核解離液不僅分離大豆根的細胞核效果較好，而且由此對應的細胞周期分析實驗結果可靠，為進一步研究逆境對大豆核內復制水平的影響提供技術支持。本研究為使用流式細胞儀簡便、快速、準確地研究大豆細胞核DNA的含量、細胞周期和遺傳倍性奠定了基礎

4 結論

本研究利用流式細胞儀分析對比了6種細胞核解離液的分離效果，找到了適合大豆葉片及根組織的細胞核解離液。其中Galbraith’s核解離液的核分離效果最好，LB01核解離液次之，但LB01核解離液可檢測到顯著的G2/M 期峰，在細胞周期及遺傳倍性中相對更好。進一步通過比對不同大豆品種中PEG處理前后根尖細胞核細胞周期，表明LB01核解離液亦具有良好的適用性及應用性。