活性天然產物蛋白靶點的快速篩選策略

陳鵬

（中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京 100700）

活性天然產物是來源于自然界中具有生物活性和藥用潛力的化學物質［1-2］。從意外發(fā)現(xiàn)青霉素到從柳樹皮中提取的阿司匹林［3-4］，歷史上天然產物及其衍生物占創(chuàng)新藥物總數(shù)的一半以上［5］。中藥是豐富的天然產物資源庫，從青蒿中提取的青蒿素直到今天仍是全球抗擊瘧疾的重要武器［6］，從砒霜得到的砷制劑成為治療白血病的良藥［7］。

現(xiàn)代藥物的研發(fā)通常從靶點出發(fā)，經(jīng)過計算機設計，合成，篩選，藥效驗證，具有較明確的藥理毒理說明［8］，而活性天然產物的篩選和使用往往基于實際藥效篩選，在成藥過程中需要對其藥理和毒理進行補充性研究［9］。蛋白質是細胞功能的主要行使者，細胞依托于蛋白質的功能完成生命周期中的各種生命活動。藥物的重要作用途徑是與蛋白質等大分子相互作用對細胞生命活動完成調控［10-11］。篩選和揭示天然藥物的靶點，是天然產物成藥過程中藥理和毒理解釋不可或缺的環(huán)節(jié)［12-14］。藥用植物資源的提取利用是提高藥用植物資源附加值的重要方式，中藥的科學內涵需要進行深入研究和闡釋，尋找和鑒定中藥的藥物靶點特別是復方制劑，是理解其藥理和有效物質基礎的關鍵步驟［15-17］。在對抗新型冠狀病毒引起的疫情（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）中，一些中藥制劑展現(xiàn)了良好的療效［18］，明確其藥物靶點能夠為其在國際推廣提供科學依據(jù)。

傳統(tǒng)的天然產物的蛋白靶點發(fā)現(xiàn)是利用探針標記的方法對天然產物進行示蹤［19］，對靶點蛋白進行親和純化后進行鑒定，不論是早期簡單的標記生物素、微球還是后來發(fā)展的柔性探針，活性探針，光催化探針等都無法避免固有的缺陷，首先探針合成依賴于專業(yè)的化學平臺，合成和表征的時間長，延長了藥物研發(fā)周期，其次天然產物的標記大多會改變其原有的結構，影響其活性［20-22］。針對以上問題，近年來發(fā)展了各種基于非標記的快速天然產物靶點篩選技術。這些技術整體上可以歸納為兩大類，一類是利用天然產物自身以及與靶點互作的理化性質進行直接篩選；另一類是利用基因組文庫或者生命體宏觀表型變化對靶點進行間接篩選。本文從以上角度綜合靶點驗證的技術對目前活性天然藥物的快速篩選方法進行綜述，以期給讀者帶來有益參考。

1 活性天然產物蛋白靶點的直接篩選策略

1.1 基于天然產物自身理化性質的篩選策略

天然產物結構多樣，含有共軛結構體系的分子往往具有紫外吸收，測定紫外吸收強度是這類物質檢測的常用技術手段［23-24］，同時大共軛體系、分子環(huán)化以及苯環(huán)等官能團的存在使得一部分天然產物具有熒光屬性，在一定波長的激發(fā)光下可以自發(fā)熒光，如白藜蘆醇等物質具有一定的自發(fā)熒光［25］，這些特殊理化性質的存在使得在篩選此類藥物的靶點時帶來便利。利用藥物的自發(fā)熒光可以研究細胞對藥物的利用吸收［26］，藥物的細胞定位，結合凝膠電泳和質譜技術可以方便快速的找到藥物結合的蛋白靶點，進而進行分子機制的研究。此類方法只局限于部分天然藥物，很多具有重要價值的藥物沒有明顯的紫外吸收和熒光光譜，比如青蒿素［27］。

1.2 基于天然產物靶點蛋白質穩(wěn)定性的直接篩選

通常小分子藥物與靶蛋白的結合會增加蛋白的穩(wěn)定性，研究人員利用藥物小分子對蛋白質氧化、酶解、加熱過程中穩(wěn)定性的影響，結合蛋白質組學技術開發(fā)了一系列藥物靶點的非標記快速篩選方法［28］。

1.2.1 基于靶點氧化穩(wěn)定性開發(fā)的SPROX技術基于氧化穩(wěn)定性結合定量質譜蛋白質組學，研究人員構建了SPROX（Stability of Proteins from Rates of Oxidation）技術，這種技術以不同濃度鹽酸胍處理混合蛋白（細胞組織裂解液），然后用同樣條件的H2O2處理，用蛋白質組學定量氧化的甲硫氨酸的氧化比例，藥物的加入會使得靶點蛋白質結構穩(wěn)定性增加，進而減少甲硫氨酸暴露和氧化。作者以免疫抑制劑環(huán)孢素A（Cyclosporin A，CsA）和酵母蛋白為例進行了研究，發(fā)現(xiàn)CsA能顯著降低10種蛋白質中甲硫氨酸的氧化比例，其中cyclophilin A和UDPglucose-4-epimerase是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的兩種效應靶點，另外8個靶點同時為研究該藥的脫靶效應提供了思路，同時利用該方法還能夠對天然產物與靶點蛋白的結合親和力進行測定［29］。

Geer Wallace等［30］利用該技術結合標記定量蛋白質組學研究了天然產物manassantin A潛在作用靶點，該技術也可以研究生命過程中蛋白質穩(wěn)定性的差異，蛋白質結構穩(wěn)定性是近年抗衰老領域的研究熱點，Roberts等［31］利用該技術研究了衰老模型小鼠與青年小鼠腦中蛋白質穩(wěn)定性的差異，為尋找抗衰老的蛋白質治療靶點提供了示范。

1.2.2 基于靶點酶解穩(wěn)定性開發(fā)的DARTS技術 DARTS（Drug affinity responsive target stability），是基于藥物親和反應提高靶點蛋白抗蛋白酶水解的特性開發(fā)的新技術。Lomenick等［32］首先利用小分子雷帕霉素、FK506 抑制劑和其重組表達的靶蛋白FKBP12進行了原理驗證，實驗結果表明加入與該蛋白結合的小分子可顯著提高其抗蛋白酶水解的特性，且與小分子濃度呈依賴性，同時mTOR激酶與其抑制劑E4的相互作用也驗證了上述原理。該團隊運用該技術進行實踐，成功的篩選出了白藜蘆醇調控真核轉錄的靶點蛋白EIF4A，Lomenick認為該方法不僅僅體現(xiàn)在對非標記小分子產物靶點篩選得適用，而且也可以在生物分子相互作用篩選之間廣泛適用［32-34］，近年來該方法在天然產物應用領域應用比較廣泛［35］。該技術也具有一定的缺陷，酶解法對低豐度的蛋白損失嚴重，裂解液使用具有限制，獲得的靶點傾向于高豐度的蛋白。小分子本身對酶活的影響以及復雜的蛋白間相互作用也可能帶來結果的偏差，同時該方法也受凝膠、液相分離和質譜儀器的檢測限的影響［20］。

1.2.3 基于靶點熱穩(wěn)定性開發(fā)的CETSA/TS-FITGE/TPP/ITSP技術 基于靶點熱穩(wěn)定性開發(fā)的靶點篩選技術是近幾年研究的熱點，實驗證實大部分情況下小分子和其靶點作用能夠增加靶點的穩(wěn)定性，同樣靶點蛋白質隨溫度變化的變性曲線會因為與配體小分子的結合而變化，靶點蛋白的降解溫度和變化趨勢可以作為區(qū)分靶點蛋白和其他蛋白的一個參數(shù)，進而完成靶點蛋白的篩選工作［36-38］。相比于氧化穩(wěn)定性和酶解穩(wěn)定性，靶點蛋白熱穩(wěn)定性無需化學試劑的添加，而是直接采用加熱超速離心，結合分離定量等技術測定對照組和藥物干預組可溶性蛋白的差異［39］。該原理基于不同的蛋白質定量差異分析方法，形成了不同的細分技術種類。

研究人員將熱穩(wěn)定性與凝膠電泳和免疫印跡結合對藥物特異蛋白靶點結合進行了分析，建立為細胞熱穩(wěn)定性遷移試驗CETSA（Cellular Thermal Shift Assay）技術，在溫度和加熱時間保持恒定的情況下，可獲得與藥物濃度依賴性的可溶性靶點蛋白特異性圖譜，這種方法依賴于特異性的抗體，因此通量較低［40］。另一組研究人員將熒光定量二維凝膠電泳蛋白質組技術與熱穩(wěn)定性原理結合起來，繪制藥物干預下蛋白的熱穩(wěn)定性遷移曲線，開發(fā)出基于凝膠的蛋白質組學篩選藥物靶點的新方法TS-FITGE（In-gel fluorescence difference caused by thermal stability shift），成功找到了大麥芽堿（Hordenine）新的藥物靶點并進行了體外驗證［41］。但無論是普通的還是半定量的熒光染色差異凝膠二維電泳，其分辨率都有限。

研究人員將熱穩(wěn)定性與定量質譜蛋白質組學技術聯(lián)合運用在建立了TPP（Thermal proteome profiling）方法，在這項工作中細胞裂解液全蛋白在與廣譜激酶抑制劑staurosporine反應，然后在不同溫度下加熱，使用基于質譜的工作流程從每個樣品中提取、鑒定和定量可溶性蛋白質。利用這種方法作者分析了激酶抑制劑staurosporine對其50多個靶點的影響，鑒定出血紅素生物合成酶鐵螯合酶作為該激酶抑制劑的新靶點，并認為它的抑制作用導致了使用 vemurafenib和alectinib觀察到的光毒性，同時還觀察到該藥物治療下游通路蛋白的熱遷移［42］。利用該技術還發(fā)現(xiàn)methotrexate、（S）-crizotinib 和2'3'-cGAMP的細胞內作用靶點，其中發(fā)現(xiàn)2'3'-cGAMP與先天免疫信號傳導的跨膜受體STRING蛋白相互作用［43］。

隨后研究人員對該方法進行了更加詳細的描述，并對裂解液，離心條件，蛋白質酶切條件，質譜數(shù)據(jù)分析流程等進行了系統(tǒng)的優(yōu)化［44-45］。基于靶點熱穩(wěn)定性的技術也不可避免的存在一些缺陷，比如低豐度蛋白易降解難以檢測，產生的大量數(shù)據(jù)難以分析，藥物對熱穩(wěn)定性的影響具有不確定性以及間接作用的影響帶來假陽性。Ball等［46］提出TPP技術溫度設置點過多，操作繁瑣成本高，他們開發(fā)了基于單一溫度的熱穩(wěn)定性靶點篩選方法iTSA（Isothermal shift assay），該技術操作簡單，理想的情況下效率更高。

1.2.4 聚合物捕獲法 特異性聚合物捕獲法UPT（Unique Polymer Technology）不同于基于靶點穩(wěn)定性的方法，研究人員合成了一些特異的高分子聚合物材料，這些材料能夠非共價結合小分子藥物，進而捕獲與小分子結合的蛋白靶點。研究人員將雙吲哚甲酰胺III（GSK3β的抑制劑）固定在聚合物表面，用免疫印跡分析方法證明了GSK3β的特異性捕獲［47］。UPT的方法顯然相對于以上基于穩(wěn)定性的方法操作更加簡單［48］，該方法的局限性是不僅僅把與小分子相互作用的靶蛋白富集出來，而且還會富集與靶蛋白相互作用的其他蛋白質，假陽性率較高［48］。

2 天然產物靶點間接篩選方法

2.1 基因組文庫篩選

基因組文庫篩選是通過分子生物學方法得到基因敲除、表達量降低、過表達、突變的個體或者細胞，并將含有以上不同基因的模式生物個體或者細胞集合成文庫，進行高通量藥物靶點篩選的方法。利用基因文庫對研究對象-天然產物進行藥效學評價，產生藥性改變的對象可能就是敲除了天然藥物對應的靶點，例如在敲除掉特定基因的細胞如果產生了對藥物的耐藥性，那么該基因編碼的蛋白就有可能是藥物的靶點。基因文庫構建的方法主要有RNAi，同源重組，基因編輯等方法［49］。酵母是一種應用廣泛具有價值的研究疾病和藥物作用機制的模式生物，擁有遺傳易感，穩(wěn)定，培養(yǎng)簡單的特點［50］。基于酵母建立的基因缺失、過表達的文庫已經(jīng)廣泛應用于篩選藥物的靶標［51］。最近，基于基因編輯技術CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas9技術獲取的真核細胞文庫也已經(jīng)構建和應用［52-53］。

2.2 其他間接篩選方法

除了通過天然產物小分子與靶點蛋白結合后理化性質的改變作為篩選方法，也可以間接的通過藥物刺激后觀察細胞生理、信號通路蛋白或者基因水平的變化，進而利用功能分析和生物信息學輔助判斷可能的靶點蛋白。例如，活性產物小分子對血管生成產生影響、誘導自噬等現(xiàn)象［54-55］，就可以推斷分子可能的作用靶點范圍，進而利用分子生物學方法逐一驗證，針對虎杖苷誘導腫瘤細胞產生氧化應激的現(xiàn)象，結合蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)虎杖苷是一種新的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的抑制劑［56］。雷公藤甲素表現(xiàn)出強烈轉錄抑制現(xiàn)象，根據(jù)這一現(xiàn)象研究人員借助中心法則原理，推導并驗證出RNA聚合酶Ⅱ的亞基XPB是雷公藤甲素的靶點，解決了困擾科研人員多年的問題［57］。值得一提的是，無論是輔助組學技術進行候選靶點的篩選，還是計算預測可能的結合位點，生物信息學都深度參與了整個研究過程，隨著人工智能的發(fā)展，這一趨勢將更明顯，甚至起到?jīng)Q定性作用［58-59］。

3 天然活性產物靶點確證方法

在篩選得到天然產物的候選靶點后，需要進一步的進行確證，直接的方法就是采用與篩選方法一致的技術，如可以通過靶點的純蛋白與小分子進行結合前后的穩(wěn)定性測試，如果小分子與蛋白質之間是共價結合，還可以采用質譜的方法測量結合分子后蛋白的分子量，從而判斷結合的小分子數(shù)目，甚至解析結合的位點［60-62］。除了這些常規(guī)的方法，還可以通過測量小分子與蛋白結合前后的理化參數(shù)來做出判斷，常用的方法有：等溫滴定量熱（Isothermal titration calorimetry，ITC）、表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）、光譜法、原子力顯微鏡、核磁共振法等［63-64］。

4 展望

中藥以及活性天然產物源自長期的實踐，具有真實可靠的療效，篩選挖掘其藥物靶點可能發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，同時新的藥物靶點的發(fā)現(xiàn)也為天然藥物的結構改造，設計新的藥物提供了思路。如圖1所示，藥物與靶點就像太極圖的陰陽互補的兩面，“藥-靶互動”的思想將會促進新藥的創(chuàng)新與改造。

圖1 活性天然產物蛋白靶點快速篩選與驗證策略總結

目前針對復方中藥復雜組分的藥物靶點篩選，主要是利用生物信息學網(wǎng)絡藥理學進行的［65-67］。在COVID-2019疫情中也大量涌現(xiàn)了基于網(wǎng)絡藥理學的研究成果［68］。組分復雜的中藥復合物是很難通過化學標記的方法進行分析，單個組分的研究也不可能解釋中藥復方多組分多靶點的優(yōu)勢，借助非標記化合物的蛋白質靶點新型篩選策略，從宏觀角度研究中藥復方的靶點群，可能會對中藥的復方的分子機理解釋、解決中藥注射液不良反應等問題提供幫助。

中藥的現(xiàn)代化需要科學的手段對中藥的科學內涵進行闡釋。尋找和鑒定中藥的藥物靶點，是理解中藥藥理和明確其有效物質基礎的關鍵步驟。生物化學的發(fā)展給我們提供了有可能解決這些問題的技術手段。在COVID-2019新型冠狀病毒引起的突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，一些老藥、中藥、天然產物顯示出明顯的療效［69-70］，快速的篩選這些藥物的作用靶點，可以為這些藥物的應用和推廣提供科學依據(jù)和信服的實驗藥理證據(jù)。本文總結了活性天然產物效應靶點的快速篩選策略，探討了各種技術的優(yōu)缺點及前景，希望能夠對相關研究提供新的思路。