代謝組學在水產品品質與安全中的研究進展

李銳 孫祖莉 楊賢慶 李來好 魏涯 岑劍偉 王晶趙永強

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所 農業農村部水產品加工重點實驗室，廣州 510300；2.煙臺大學生命科學學院，煙臺 264005；3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心 大連工業大學，大連116034）

水產品營養價值高，是人類膳食中重要的動物蛋白質來源之一［1］。隨著人們飲食習慣的改變，對鮮活及加工水產品的需求量逐年增加，但水產品受生長環境、微生物、貯運條件及加工方式等因素影響，具有易污染和易腐敗變質等特點［2］，據統計，全球每年因腐敗變質而失去食用價值的水產品占比高達30%［3］。隨著生活水平的提高，消費者對于品質好、安全性高的水產品的需求不斷增加，為此水產品品質與安全的分析檢測成為研究熱點。

科技高速發展，高通量檢測技術也隨之更新，以基因組學（Genomics）、轉錄組學（Transcriptomics）、蛋白質組學（Proteomics）和代謝組學（Metabonomics）為代表的組學技術得到迅速發展，并逐漸應用在解決食品安全、質量和營養等方面的問題，成為現代食品科學研究的重要工具［4-6］。其中，代謝組學是以最終代謝產物為研究對象，定性定量分析生物系統在受到刺激后機體內的小分子代謝物的變化情況，從而反映其應激代謝應答信息［7］。基因、轉錄和蛋白質3種組學技術主要是分析檢測樣品可能發生的變化，而代謝組學就是確定水產品以及水產品加工過程中使用的微生物的代謝物的變化。通過代謝組學檢測分析，可以對引起水產品品質與質量安全變化的具體風險因子進行研究，對養殖營養代謝、微生物、貯運和加工等許多直接影響產品質量的因素進行全面分析，從分子水平探究水產品各項的理化指標變化的作用機制，為水產品品質與安全調控提供根源性、多角度及全方面的理論依據等優勢［8-9］。近年來，越來越多的研究者將代謝組學技術應用于水產品安全與質量控制的研究中，從而更精確、深入了解水產品品質變化機理、探明其分子作用機制，提出了更合理有效的水產品品質與質量安全的調控方法。本文對代謝組學技術進行了介紹，綜述了代謝組學技術在水產品原料鑒定、貯運保鮮、加工產品品質與安全領域的應用進展，旨對其進一步應用提供思路。

1 代謝組學概述

代謝組（Metabolome）是1998年Tweeddale等［10］在研究大腸桿菌的代謝時首次提出，定義為“代謝物整體”（Total metabolite pool），指細胞、組織、器官或者生物體內相對分子量小于1 kD的內源性小分子的集合。代謝組學通過應用各種高通量分析化學對實驗樣本進行系統分析，檢測其中的內源性小分子代謝產物含量、組成成分，且利用模式識別方法對這種變化進行預測，確定生物標志物群體或者標志物簇（Biomarker clusters）［11］，以此尋找因刺激而受到影響的相關代謝途徑，探究生物體內源性代謝物質整體及其變化規律。根據研究對象不同，代謝組學可以分為分析未知化合物的非靶向代謝組（Untargeted metabolomics）和研究已知化合物的靶向代謝組（Targeted metabolomics）［12］。非靶向代謝組學又稱發現代謝組學，將對照組和實驗組的代謝物進行比對，從中找出兩組間的差異代謝物，并進行代謝物鑒定，進一步解釋差異代謝物在其參與的代謝通路中發揮的生物學作用。與非靶向代謝組學相比，靶向代謝組學更具針對性，分析檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好等特點，能對目標代謝物在樣品中的絕對含量進行測定和分析驗證，對非靶向代謝提出的假說［13-14］。靶向代謝組學是研究少數幾種或幾類結構、性質相似或生化功能相關的內源性代謝物，如與品質安全密切相關的脂質代謝組學、糖代謝組學和氨基酸代謝組學等［15］。

2 代謝組學技術

代謝組學以高能量檢測和數據處理為手段，描繪出機體代謝物譜，即代謝輪廓，之后再利用統計學和生物信息學方法進行數據處理，研究機體的變化應答機制，為水產品品質變化與安全性的檢測及調控開辟了一條新的道路。代謝組學技術的研究流程一般包括樣品制備、樣品預處理、化合物分離、檢測及鑒定、數據分析［16］。

化合物分離和檢測鑒定是代謝組學技術的核心步驟，在對樣品進行處理之后，對代謝物進行檢測鑒定的儀器分析技術至關重要［17］。在食品科學領域代謝組學常用的檢測技術主要是有核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）技術和質譜技術［18］。由于樣品中不同代謝物的分子量大小、極性、揮發性和穩定性有著很大的差別，所以不同的檢測技術也都具有各自的優勢與局限。核磁共振技術是代謝組學研究中最為常見的檢測技術，其對樣品要求簡單，不需要復雜的前處理技術，具有對樣品無破壞性的優點，能夠客觀研究樣品內部化學變化和生化反應［19］。常用的核磁共振技術包括核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）、核磁共振氮譜（15N-NMR）和核磁共振磷譜（31P-NMR），其中以1H-NMR的應用最為廣泛［20］。相較于NMR技術，質譜技術的分辨率和靈敏度更高［21］，質譜（Mass spectrometry，MS）、飛行時間質譜（Time of flight mass spectrometer，TOF/MS）和高分辨質譜（High resolution mass spectrometry，HRMS）是代謝組學研究中經常用到的技術，在研究中根據研究對象與目的不同可與氣相色譜（Gas chromatography，GC）［22］、 液相色譜（Liquid chromatography，LC）［23］、毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）［24］等技術聯用，先對樣品進行分離，再進行質譜檢測。除了上述常用的質譜技術，快速蒸發離子化質譜（Rapid evaporative ionization mass spectrometry，REIMS）作為一種新興起的技術具有無需前處理、檢測時間短、能對樣品進行高通量實時監測等優點，逐漸應用于代謝物的分析檢測［25］。代謝組學得到的數據量巨大，先對原始數據進行預處理，保留與組分相關的信息，消除多余干擾因素的影響［26］，借助化學計量學對數據進行分析處理，主要包括主成分析（Principal component analysis，PCA）、聚類分析（Cluster analysis，CA）、最小二乘法（Partial least squares，PLS）、顯著性分析（Discriminant analysis，DA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）等方法［27］。

3 代謝組學在水產品品質與質量安全研究中的應用

從原料到產品，水產品從產地到消費者手中，引起其品質差異的差異主要包括：原料本身養殖方式、營養水平、產地來源的差異；貯運過程自身內源酶作用和外界刺激引起的不同程度的腐敗變質；不同加工工藝產品的安全性、營養性差異。這些差異都會通過不同的代謝產物表現出來，通過對于其代謝產物的具體分析研究，可以更準確分析與評價水產品的食用品質與安全，但是代謝物的種類眾多、結構復雜，想要獲得更準確、更完善的代謝物分析也將是一項挑戰。

3.1 代謝組學在水產養殖與營養中的應用

水產養殖條件與方式是提供優質水產品原料的重要條件，伴隨水產養殖業的快速發展以及動物營養和飼料科學理論知識的普及，飼料在水產養殖中的需求與日俱增，不同的飼料種類與配比以及部分營養物質的添加對水產原料具體的營養品質有極大的影響。因此，需要進一步了解喂食不同飼料對水產動物體內營養代謝的影響，從而為養殖高品質的水產原料提供理論依據。

代謝組學可以對水產原料在養殖期間投喂飼料的生長代謝情況進行監測，對其引起的代謝活動、生物特性（抗氧化性、免疫力等）及營養組成的變化作出解釋。中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱河蟹，是我國主要的養殖蟹類之一。馬倩倩［28］利用基于GC-MS代謝組學方法，探討了不同脂肪源（棕櫚油、橄欖油、紅花籽油和紫蘇籽油）對幼蟹生長及生理代謝的影響，以生長性能、抗氧化指標、免疫指標、消化酶活性、糖脂代謝酶活性以及肝胰腺組織結構的影響作為評價指標，發現四種不同脂肪源中棕櫚油是一種較好的河蟹脂肪源，而紫蘇油的促生長效果最差，過量添加還會引起肝胰腺的氧化應激，造成肝胰腺的氧化損傷；趙磊等［29］也通過GC法對以植物油代替魚油作為飼料喂養的河蟹的脂質代謝水平進行測定，發現混合植物油合理替代魚油有利于河蟹肝胰腺脂質的吸收、轉運和積累，提高機體的抗氧化和免疫性能，減少氧化損傷。此類研究結果為開發中華絨螯蟹高脂飼料適宜脂肪源的選擇、完善人工配合飼料提供了依據。Schock等［30］運用基于1H-NMR代謝組學技術評估了飼料中不同魚粉含量（25%、50%和 100%）對軍曹魚（Rachycentron canadum）代謝的影響，發現飼料中魚粉的含量與軍曹魚血清酪氨酸和甜菜堿水平呈負相關，與葡萄糖和乳酸水平呈正相關，表明飼料中魚粉含量對軍曹魚的生長健康狀況影響較大，含量減少會導致軍曹魚因缺營養物質維持生長被迫降解機體的蛋白質，從而導致機體本身蛋白含量降低。牛磺酸普遍存在于哺乳動物和水產動物中，具有參與脂肪代謝、氨基酸代謝、糖代謝以及滲透壓的調節等生理功能，對魚類的生長有促進作用，黃穎［31］基于NMR代謝組學技術對飼料中添加牛磺酸對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的影響進行探究，發現適量添加牛磺酸可以促進尼羅羅非魚的生長速度以及提高粗脂質和粗蛋白水平，過量添加則會抑制生長，牛磺酸的添加對尼羅羅非魚機體產生了顯著影響，相關代謝通路涉及糖代謝、蛋白質合成與代謝、脂質合成與代謝、核苷酸代謝、牛磺酸合成等，研究揭示了牛磺酸對尼羅羅非魚代謝的調控機制，為魚類營養學研究提供依據。

水產動物飼料成分與其肌肉營養成分有很大的相關性，通過代謝組學技術研究水產養殖過程中飼料組成配比對水產動物代謝的影響，可了解不同飼料在水產動物生長代謝中的具體作用，總結代謝規律后根據其代謝規律優化養殖方式，進而可以提高水產品質。代謝組學的發展可為養殖高品質的水產原料提供合理可行的理論依據，為水產養殖產業帶來更多機遇。

3.2 代謝組學在鑒別鑒定水產品原料中的應用

食品摻假、欺詐是世界性的問題，隨著部分水產品因特殊的地理位置、養殖方式等原因具有較高的市場價值，為了獲取更高的利潤，市場上不乏以次充好的產品，造成水產品市場混亂，產品品質與安全得不到保障。對水產品的原料種類，產地的鑒別，是處于水產品供應鏈的質量控制的最初端的重要工作，由于水產品的原料與產品的化學組成復雜，不同原料與產品之間差異不明顯，為鑒別工作提出了更高的要求。

代謝組學的發展為鑒別水產品品種和產地提供新的方法，通過代謝差異從而鑒定產品質量。Rochfort等［32］通過對澳大利亞藍貽貝（Mytilus galloprovincialis）和新西蘭綠唇貽貝（Perna canaliculus）進行了代謝組學評估，水性代謝物用NMR分析、脂質代謝物通過NMR和GC/MS分析，通過對NMR圖譜進行主成分分析（PCA）判別，將M.galloprovincialis和P.canaliculus兩個貽貝品種被分類開來，同時發現可以憑借某種化合物的含量就可將來自澳大利亞和新西蘭的兩種貽貝予以區分，但由于核磁共圖譜所能提供的結構信息太少，作者未能鑒定出此化合物。脂質組學可獲得各類水產品的脂質信息可以得到不同品種、生長環境的水產品脂質輪廓，對水產品進行鑒定，Aursand等［33］通過核磁共振碳譜（13C-NMR）與多變量數據分析結合對大西洋鮭（Salmo salar）的肌肉脂質進行檢測分析，來區分野生和養殖大西洋鮭、鑒定其原產地和驗證市場供應產品來源。因品種、生長環境、飼養情況的不同，水產品體內脂質的組成和成分也不相同，Shen等［34］采用鳥槍法比較了鯽魚（Carassius auratus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鱸魚（Lateolabrax japonicus）三者之間以磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰絲氨酸（PS）4類為主的磷脂成分的主要差異，發現可利用磷脂標記物對3種魚肉進行鑒別。Song等［35-36］通過無需樣品前處理的iKnife-REIMS（智能刀-快速蒸發離子化質譜）聯用技術對三文魚（Salmo salar、Oncorhynchus tshawytscha）和虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）進行區分，也對4種不同的金槍魚（Thunnus thynnus、Thunnus obesus、Thunnus albacares、Thunnus alaunga）進行了分析鑒定，獲得了對應的脂質組學特征，為科學評估市售三文魚和金槍魚摻假情況提供了快速、實時、準確的鑒別方法。

因品種、生長環境、飼養情況的不同，水產品代謝物質的組成和成分也不相同，由此發現代謝組學在水產鑒別上有著獨特的優勢，不但能夠對水產品原料本身具有很強的分析能力，并能更好的反映環境對水產品組分的影響。目前，代謝組學已經廣泛應用于食品認證領域，但其在水產品產地來源鑒別和質量鑒定上應用相對較少，隨著檢測技術的更新以及檢測方法逐漸簡化，代謝組學技術在水產品原料鑒別鑒定領域可逐步增加應用，擴充水產品相關分析比對數據庫的容量后，可開發成一種有用于漁業和食品機構追蹤水產品的有用工具。

3.3 代謝組學在監控水產品貯運保鮮品質變化中的應用

貯運保鮮，一直是水產研究的熱點領域，活體貯運時水產本身能夠保持一部分活體的特性，能極大得保證水產品的品質，但在貯運期間，還是會由于環境的影響導致代謝情況發生變化。通常來說，水產貯運保鮮主要在水產品死亡后對其新鮮度的保護，在水產原料死后，其肌肉代謝方式從有氧代謝轉變為無氧代謝，參與蛋白質水解的酶以及微生物將蛋白質降解為胺類等小分子物質，同時肌肉中的脂質物質也發生水解生成小分子化合物，使其新鮮度降低。水產品貯運期間普遍存在蛋白質水解氧化、脂質水解氧化引起的品質下降。

近年來，代謝組學技術在水產貯運以及水產加工制品品質方面的應用逐漸被研究者重視，能更深層次得了解和闡明水產品在貯運期間的生理變化［37］。陳山喬［38］為深入闡明在低溫半無水活體儲藏條件下扇貝（Argopecten irradians）的生理活動特點，進行了基于氯甲酸甲酯（MCF）衍生化 GC-MS的靶向代謝組學研究，經過模式識別模型的建立和代謝通路分析發現扇貝在低溫離水環境下無氧呼吸加強、有氧呼吸受到抑制并非由缺氧引起，揭示了在扇貝半無水活體儲藏的條件優化中氧氣補充是一項次要條件；另外，扇貝在低溫離水環境下能量代謝模式從終產物為乳酸改變為終產物為琥珀酸的通路也被檢測到，并且發現了與其滲透失調、氧化損傷、神經系統紊亂和低溫應激有關的數個生物標記物。Aru等［39］采用NMR代謝組學方法分析貽貝（Mytilus galloprovincialis）新鮮樣品與在0℃保存10 d（取第2、6、10天）和4℃保存6 d（取第2、6天）樣品的相關代謝特征，通過正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）揭示了新鮮樣品和存儲那些在0℃和4℃之間的明顯區別，結果證明，在儲存期間，乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、丙氨酸、支鏈氨基酸和三甲胺逐漸增加，而部分滲透物（甜菜堿、磺酸等）逐漸減少，這些代謝物與微生物計數的相關性表明它們被可用作腐敗的潛在生物標志物。以上研究結果表明代謝組學技術可以作為提供水產品新鮮度信息的有力工具。Jaaskelainen等［40］也基于NMR代謝組學探究大西洋鮭和金槍魚（Thunnus albacares）魚片在真空包裝3℃下冷藏12 d的品質變化情況，結果顯示冷藏12 d后兩種魚片品質都有下降，但鮭魚魚片視為已經變質，并且發現三甲胺是主要的腐敗產物，研究表明鮭魚比金槍魚更容易腐敗。Chen等［41］通過鳥槍法脂質組學發現牡蠣（Crassostrea plicatula）在4℃貯藏7 d后，磷脂因磷脂酶的催化發生明顯降解，而在-20℃下磷脂的含量幾乎不改變，表明在不同的貯藏溫度下，水產品貯藏過程中磷脂的水解機理與脂質水解酶活性有關。無獨有偶，Wang 等［42］也通過鳥槍法脂質組學研究了不同貯藏期的草魚肌肉組織中磷脂變化，結合微生物計數揭示了不同階段微生物對磷脂氧化與降解規律。

水產品貯運保鮮對提高水產品經濟價值極為重要，同時也是影響水產品安全與品質的重要環節，通過代謝組學對貯運期間代謝物的分析可以更好地了解水產品品質變化情況，不僅可以篩選出相關生物標記物作為監控水產品貯運保鮮情況的指標，同時在了解代謝路徑后，能夠從機理上解釋水產品的腐敗變質的原因，為貯運期間品質與安全的調控提供了更加科學有效的思路與方法，降低水產品在運輸貯藏方面的損耗，保證產品質量。

3.4 代謝組學在確定水產加工產品品質及安全中的應用

水產品加工類型繁多，工藝繁簡不一，加工工藝的不同、各類調味品的加入以及個別產品需要微生物的引入等，這些都會對其品質與安全產生影響。發酵和腌制是我國為提升水產品品質及延長貨架期較為常見的加工方式。在發酵和腌制過程中很容易形成多樣的微生物群落，并且產生大量的代謝物，除了產生對產品有益的物質，也會產生生物胺、亞硝酸鹽等有害代謝物，對產品本身品質與安全存在不確定威脅。

代謝組學可以對發酵和腌制過程中物質的變化和風味物質的產生進行監控和分析、對加工后的成品進行檢測，詳細的代謝物組成為其質量和安全性的評定提供參考。Chen等［43］結合使用NMR和多變量數據分析研究了蟹醬在發酵過程中代謝物分布的動態演變，研究結果表明發酵對蟹膏質量有顯著影響，質量變化表現為乳酸、甜菜堿、牛磺酸、三甲胺-N-氧化物、三角堿、肌苷、二磷酸腺苷、2-吡啶醇的下降，一系列氨基酸的波動以及谷氨酸、蔗糖、甲酸、乙酸鹽、三甲胺和次黃嘌呤的積累，三甲胺含量隨發酵水平的提高可作為蟹膏的新鮮度指標，這些結果為蟹膏的質量評價提供了依據，并證實了代謝組學技術是提供蟹黃膏質量重要信息的有效工具。Wang等［44］首次使用基于UHPLC-Q/TOFMS的代謝組學方法來評估中國魚露的味道品質和代謝物特征，在發酵過程中從魚醬樣品中提取了總共22 816個代謝物離子特征，包括氨基酸、小肽、有機酸、胺和碳水化合物和核酸在內的46種代謝物被確定為魚醬的關鍵化學成分。帶魚（Trichiutus lepturus）在我國分布廣泛，產量高，通過食鹽腌制和風干成熟制得的傳統腌干帶魚因其獨特的風味而廣受歡迎，關于其研究主要集中于鹽析過程中形成致癌亞硝胺的亞硝酸鹽，而脂質氧化等方面研究較少。Wu等［45］為探究帶魚（深色肉、白色肉）在腌干過程帶魚的脂肪氧化情況，通過分析過氧化值（POV）、TBARS值、由GC-MS技術定量的脂肪酸（Fatty acids，FAS）和由ESI-MS/MS技術定量的三脂酰甘油（Triacylglycerols，TAG）來評估鹽腌過程脂肪氧化情況，結果5種FA的營養指數顯示，腌干加工對FA的營養價值的影響在白色肉魚類中比在深色肉中更大；深色肉帶魚中的脂類成分以TAG為主，兩種帶魚的TAG組成相同，但其在腌干過程變化趨勢不同。該研究創新評估了帶魚腌干過程中脂肪氧化情況，為研究帶魚以及與帶魚相似的高脂魚腌干過程脂肪氧化提供了新的思路，也為該類腌干魚肉制品的規模化生產奠定理論基礎。我國常見的帶魚烹飪方式為油炸，空氣油炸由于安全方便、用油量少近年來逐漸替代傳統油炸加工，張蒙娜等［46］將經空氣油炸后的帶魚直接通過REIMS系統實時檢測得到脂質組成，探究不同溫度對脂肪酸和磷脂的影響，結果表明二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）為含量最高的脂肪酸，含量最多的磷脂分子形式是磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl ethanolamines，PE）和磷脂酰膽堿（Phosphatidyl cholines，PC）；同時發現，脂質分子的飽和度隨著油炸溫度的升高而提高，DHA含量由38.91%降低至30.74%。空氣油炸溫度對食物品質有著較大的影響，該研究實時監測空氣油炸對帶魚脂肪組成的影響，為控制空氣油炸溫度提供了理論指導。

代謝組學對水產發酵制品在發酵過程的化學成分進行廣泛表征，以及解析發酵水產品品質相關微生物作用機制探明方面具有實用性，為發酵引起的水產品的口味品質提供了新穎的見解，并為以后的研究提供了指導。關于腌干魚制品研究方面，目前主要集中在腌制加工過程亞硝酸鹽及其胺類物質的產生規律和控制技術，以及傳統加工方式向工業規模化現代化加工技術的推廣進程。因此，代謝組學技術的引進，能夠對腌干魚工藝中的關鍵組分進行檢測，除了定量有害物質，并能夠對工藝中產生的對產品有益相關代謝物進行鑒定，能保障產品安全優質性。烹飪加工技術對居民飲食健康安全具有重要影響，通過代謝組學技術可以得到食物加工后的小分子物質具體組成，從而可以設計合理、安全、健康的烹飪條件，提高居民飲食質量。

4 總結與展望

中國作為世界漁業大國，為消費者提供品質高、質量安全有保障的水產品對提高我國居民健康水平、促進我國水產品加工產業高質量發展與保障我國“藍色糧倉”戰略實施具有重要意義。隨著各種檢測技術逐漸成熟、交叉互作，代謝組學技術逐漸應用于水產品原料鑒別、貯運保鮮和加工過程中標志指示物的篩選與分析，為水產品品質與安全調控奠定更詳盡的理論基礎。

由于水產品品質與安全變化中的代謝產物受養殖、貯運、加工等過程中多種因素的影響具有復雜性，不同的養殖環境、飼料組成、貯運條件、加工方式都會對水產品原料和加工產品造成直接或者間接的影響，要全方位地探究水產品品質變化的情況，單靠代謝組學技術檢測分析具有局限性和片面性。因此，在相關問題研究中，可以加入基因組學、轉錄組學和蛋白質組學與代謝組學相結合，多組學技術聯用可以多途徑、系統性地分析水產品品質與安全變化機制，以彌補單一組學在研究中的不足。例如，水產品中自身蛋白變性、降解、氧化，以及脂肪氧化副產物促進水產品肌肉蛋白質發生氧化從而影響水產品品質，可蛋白質組學和代謝組學技術聯用確定新鮮度指示的蛋白質點與標志代謝物，并研究在水產加工貯運期間脂肪氧化和蛋白氧化之間的相對作用。

現階段關于多組學技術聯用在水產品品質與安全應用較少，特別是在水產品貯運加工方面，需要多組學技術以不同切入點研究原料來源、微生物的組成與變化、蛋白質變性降解氧化、脂肪降解氧化及其與蛋白氧化之間的相互關系，從而進一步探究水產品品質與安全變化機理，更具針對性地調控相關品質衰敗、產品安全問題。總體說來，代謝組學技術在研究水產品品質與安全中的應用有待進一步的提高，與其他組學技術聯用，同時結合生物信息學、數學建模和建立數據庫等方法，促進代謝組學技術在水產品品質安全中的應用，以保障品質好、安全性高的水產品供給。