線粒體融合蛋白參與調(diào)節(jié)女性生殖功能的研究進展

孔德琦，姚桂東，孫瑩璞

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心 鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖與遺傳專科醫(yī)院，鄭州 450052)

線粒體融合蛋白(mitofusin，Mfn)，又名增生抑制基因(hyperplaisa suppressor gene，Hsg)，是一類位于線粒體外膜的三磷酸鳥苷酶(GTPase)，共有Mfn1和Mfn2兩種亞型。其中，Mfn1由位于3號染色體長臂2區(qū)6段(3q26.33)的MFN1基因編碼，Mfn2編碼基因則位于1號染色體短臂3區(qū)6段(1p36.22)。Mfn家族催化線粒體外膜的融合，與視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)、線粒體分裂蛋白1 (dynamin related protein 1，DRP1) 等共同參與調(diào)節(jié)線粒體的融合和分裂，進而影響線粒體的功能。Mfn N端的GTP酶結構域及與RAS結合的結構域，對于Mfn發(fā)揮特異性功能有重要意義[1]。Mfn高表達于神經(jīng)、心肌等高耗能器官，主要通過調(diào)控線粒體能量產(chǎn)生、清除氧自由基、維持自噬及凋亡等方參與調(diào)節(jié)機體多種生理病理過程[2-3]。在生殖活動中，Mfn參與調(diào)控精子質(zhì)量，弱精子癥患者精子中Mfn2表達水平顯著下降且精子解凍不存活風險大大增加[4]；同時Mfn表達于女性卵巢卵泡顆粒細胞及卵母細胞[5]，參與卵泡發(fā)育、卵子成熟及排卵等生殖過程。本文將重點綜述Mfn在雌性哺乳動物生殖功能調(diào)控中的研究進展。

一、Mfn參與卵泡發(fā)育

卵泡是卵巢的基本功能單位。女性出生時，雙側(cè)卵巢內(nèi)儲存大量原始卵泡，進入青春期后，99%的原始卵泡發(fā)生閉鎖，僅剩不到1%的原始卵泡。這些原始卵泡在體內(nèi)成熟激素水平的刺激下，卵泡外側(cè)顆粒細胞增殖分化，卵泡內(nèi)初級卵母細胞減數(shù)分裂，直至成熟竇卵泡形成并排出卵子。在卵泡發(fā)育過程中，卵母細胞中線粒體不僅數(shù)量逐漸升高，同時形態(tài)和空間分布均發(fā)生改變，從而為卵母細胞減數(shù)分裂和染色體的分離奠定基礎。此外卵泡顆粒細胞線粒體受損也極大程度影響卵泡發(fā)育潛能[6]。

1.Mfn促進竇前卵泡向竇卵泡轉(zhuǎn)化：有研究通過特異性敲除小鼠卵母細胞Mfn1發(fā)現(xiàn)，小鼠生育能力喪失，竇卵泡的數(shù)目及GV期卵母細胞數(shù)目均顯著下降，且無成熟卵細胞及受精后雙原核形成；線粒體形態(tài)也出現(xiàn)了顯著差異，線粒體體積增大、縱橫比降低而且其ATP生成顯著下降[7-8]。Machado等[9]近期的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵母細胞特異性敲除Mfn1以及Mfn1和Mfn2雙敲除后，小鼠均不育；然而Mfn2單敲除小鼠的生育能力并不受影響，說明在卵泡發(fā)育中Mfn1的作用是不可缺少的，而Mfn2對卵泡發(fā)育似乎無明顯調(diào)控作用。與Zhang等[7]的研究結果一致的是，Mfn1特異性單敲除后，小鼠卵巢停滯在竇前卵泡狀態(tài)，不僅竇前卵泡向竇卵泡轉(zhuǎn)化受到影響，后續(xù)的排卵活動及黃體生成率均比正常對照組大幅度下降。這些結果表明Mfn1可能在后期竇前卵泡成熟階段發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而在卵泡發(fā)育早期，即原始卵泡激活以及初級卵泡發(fā)育過程中的調(diào)控作用并不明顯。

2.Mfn參與卵母細胞-體細胞交互作用：Mfn家族參與卵泡發(fā)育的機制研究[7，9]，卵母細胞-體細胞交互作用受其影響較大。在竇前卵泡向竇卵泡轉(zhuǎn)化過程中，顆粒細胞將根據(jù)部位和功能分化為兩部分：內(nèi)層的卵丘細胞緊緊包裹著內(nèi)部的卵母細胞，且通過縫隙連接進行物質(zhì)交換和代謝活動[10]；外層的壁顆粒細胞形成特化的上皮細胞，與基底膜一起位于卵泡外圍包裹整個卵泡。除了縫隙連接，卵丘細胞胞漿內(nèi)特化的突起可以穿過透明帶，進而形成卵丘-卵母細胞復合體。除了該特化的組織結構外，卵母細胞旁分泌也參與交互作用。研究最廣的旁分泌因子代表，是兩個在氨基酸序列及空間三級結構都具有高度相似性的因子：生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)。

BMP15基因定位于X染色體上，GDF9基因定位于5號染色體長臂。除始基卵泡以外，各個卵泡階段中GDF9和BMP15均有表達，其參與到卵泡發(fā)育、排卵活動和黃體生成過程中，直到卵細胞受精后[11-12]。尤其是在竇前卵泡向竇卵泡轉(zhuǎn)化中，一方面卵母細胞高表達GDF9和BMP15，調(diào)節(jié)顆粒細胞糖脂代謝并促進其合成丙酮酸、乳酸及膽固醇等，進而通過縫隙連接為卵母細胞提供營養(yǎng)[11，13]；另一方面，顆粒細胞高表達GDF9和BMP15直接作用于自身，促進顆粒細胞的增殖分化并參與卵泡刺激素介導的卵泡發(fā)育[14-15]。小鼠卵巢Mfn1和Mfn2雙敲除后[7，9]，卵巢GDF9、BMP15表達水平均顯著下降；除此之外，特異性敲除Mfn1后，GDF9表達水平下調(diào)，而BMP15表達水平不變。綜上，Mfn1及Mfn2可能參與調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)β家族介導的卵母細胞-體細胞交互作用，進而促進顆粒細胞增殖分化及卵泡的發(fā)育。

有文獻報道，使用慢病毒感染小鼠卵巢過表達Mfn2后，隨著作用時間的延長，小鼠卵巢內(nèi)卵泡逐漸發(fā)育，血中雌孕激素及卵巢內(nèi)雌孕激素受體的表達水平均發(fā)生顯著升高；而下丘腦-垂體來源的黃體生成素與卵泡刺激素表達無明顯變化[16]。表明Mfn2可能從卵巢水平，而非下丘腦-垂體水平參與卵泡發(fā)育調(diào)控。

Mfn促進竇前卵泡向竇卵泡轉(zhuǎn)化、參與卵母細胞-體細胞交互作用并調(diào)控卵泡中顆粒細胞激素分泌，在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用。此外，Mfn參與某些化學物質(zhì)的卵巢致毒機制，如氟化物可通過促進顆粒細胞中Mfn1表達，增加氧自由基損傷并破壞線粒體氧化呼吸鏈從而降低其ATP生成，抑制卵泡發(fā)育[6]。

二、Mfn參與卵母細胞成熟

卵母細胞成熟主要是指卵母細胞由生發(fā)泡期(GV期)發(fā)育至減數(shù)第二次分裂中期(MⅡ期)。Mfn1和Mfn2通過調(diào)控線粒體形態(tài)結構及空間位置，調(diào)節(jié)線粒體功能，參與紡錘體形成及同源染色體分離等參與卵子成熟。

1.參與線粒體空間位置及形態(tài)結構改變：有研究在多種哺乳動物的卵母細胞體外成熟(IVM)過程中觀察到，GV期的線粒體主要分散環(huán)繞于透明帶周圍，發(fā)育至MⅡ期時線粒體逐漸向中心遷移[17]。卵母細胞過表達Mfn1和Mfn2可以促進MⅡ中線粒體環(huán)繞紡錘體；而且過表達Mfn1和Mfn2后使用微管解聚誘導劑Nocodazole發(fā)現(xiàn)線粒體的集聚消失而分布重新變分散，證明Mfn家族可能通過微管調(diào)節(jié)線粒體時空分布；然而使Mfn1 GTPase結構域(Mfn1k88t和Mfn1t109a)突變后，線粒體核周聚集現(xiàn)象消失，證明Mfn通過發(fā)揮其酶催化作用改變線粒體形態(tài)及分布[18]，但是具體功能不詳，有待進一步研究。

Liu等[19]發(fā)現(xiàn)GV期降調(diào)Mfn2抑制MⅡ期線粒體集聚，使線粒體分散于細胞質(zhì)中；而Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)GV期降調(diào)Mfn2能促進線粒體緊密環(huán)繞于紡錘體周圍。此外，使用三維延時成像技術可以觀察到GV期過表達Mfn1和Mfn2后，隨著卵子成熟，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)集聚于線粒體所在部位，而且線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交聯(lián)，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子儲存量，影響胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。

2.參與調(diào)節(jié)線粒體功能及紡錘體形成：Liu 等[19]發(fā)現(xiàn)降調(diào)GV期Mfn2后，使用JC-1染色檢測MⅡ期卵母細胞中線粒體膜電位示，膜電位下降且MtDNA表達量明顯下降。而Dai等[21]發(fā)現(xiàn)GV期過表達Mfn1和Mfn2后，MⅡ期卵母細胞的ATP含量并沒有顯著升高。使用開放式麥管(OPS)對豬的卵子進行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)Mfn2表達量明顯降低，凋亡通路被激活而且活性氧產(chǎn)生增加。由此可見，卵子成熟過程與Mfn2密切相關，Mfn2通過抑制內(nèi)源性凋亡，促進ATP產(chǎn)生、清除氧自由基等方式調(diào)節(jié)卵母細胞成熟。

有研究發(fā)現(xiàn)，GV期過表達Mfn2及過表達Mfn1均會抑制紡錘體形成，抑制同源染色體分離[18-20]。但Mfn如何精細調(diào)節(jié)這一減數(shù)分裂過程，具體機制尚未研究清楚。

Mfn在卵母細胞中的精細表達與卵子成熟密切相關，目前該領域仍有很大研究空間，例如Mfn如何調(diào)節(jié)卵母細胞中的鈣離子穩(wěn)態(tài)，如何維持卵子發(fā)育不同時期所需的線粒體形態(tài)，如何調(diào)節(jié)同源染色體的分離等。闡明這些具體機制對于探究卵母細胞細胞質(zhì)成熟及遺傳學中染色體數(shù)目異常的形成機制具有重要意義。

三、Mfn參與生殖系統(tǒng)疾病病理發(fā)生

1.參與多囊卵巢綜合征(PCOS)的病理機制：通過外顯子測序發(fā)現(xiàn)，Mfn2可作為“上半身對稱性脂肪過多伴下肢脂肪代謝障礙伴神經(jīng)病變”的候選基因[22]，Mfn2突變后脂肪組織形態(tài)正常，而瘦素表達量下降[23]。高脂飲食的大鼠Mfn2表達降低，削弱了肝臟對胰島素的反應性[24-25]，而過表達Mfn2可改善這一點[26]。Mfn2表達水平也與骨骼肌的胰島素敏感性之間存在正相關[27]。由此可見，Mfn2參與維護多個組織器官的胰島素敏感性，并可能參與調(diào)節(jié)PCOS患者的胰島素抵抗。此外大鼠PCOS模型中Mfn2與PI3K-AKT-mTOR通路存在同向低表達現(xiàn)象[28]，暗示PCOS中的卵泡發(fā)育障礙可能與Mfn低表達相關。

2.參與維持卵巢儲備功能：Wang等[5]發(fā)現(xiàn)卵巢儲備功能低下(DOR)患者卵泡顆粒細胞中Mfn2表達量明顯低于正常組。通過對小鼠腹腔注射順鉑構建卵巢早衰(POF)模型后發(fā)現(xiàn)，卵巢儲備功能衰竭病理機制可能與顆粒細胞中Mfn2低表達抑制能量產(chǎn)生并激活凋亡通路有關[29]。此外有研究發(fā)現(xiàn)POF小鼠模型中miR-125a明顯上調(diào)并通過抑制轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)促進凋亡發(fā)生[30]；而胰腺癌細胞中miR-125a可通過mfn2抑制線粒體分裂[31]。故在參與維持卵巢儲備功能過程中，Mfn可能與miR-125a密切相關。

四、Mfn參與維護妊娠期子宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)

絨毛滋養(yǎng)層根據(jù)形態(tài)學及功能可以分為兩個部分：細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層，其中合體滋養(yǎng)層可實現(xiàn)胎盤對營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、免疫相關因子等的轉(zhuǎn)運。Mfn2廣泛分布于細胞滋養(yǎng)層與合體滋養(yǎng)層的細胞質(zhì)中，而在細胞核及絨毛間質(zhì)細胞中則無表達。Chen等[32]發(fā)現(xiàn)Mfn1缺陷不影響小鼠胎盤生成，而Mfn2缺陷導致小鼠胎盤發(fā)育不良，其中滋養(yǎng)層巨細胞數(shù)目大幅降低，提示Mfn2可能通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層巨細胞數(shù)目參與胎盤發(fā)育。此外，早期胚胎停育的患者絨毛組織中Mfn2低表達，線粒體結構功能均受損，表現(xiàn)為線粒體膜破裂、線粒體嵴排列混亂、ATP生成降低、線粒體自噬受到抑制而凋亡通路激活等[33]。Cai等[34]研究發(fā)現(xiàn)在人滋養(yǎng)層細胞中降調(diào)Mfn2后，LC3、BECLIN1、ATG5等自噬相關蛋白表達均下降，證明Mfn2通過促進細胞自噬，維持妊娠早期HCG水平及滋養(yǎng)層細胞正常功能。先兆子癇患者的胎盤中Mfn2表達水平明顯低于對照組[35]，同時血清中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)這一DNA損傷標志物隨著胎盤滋養(yǎng)層細胞Mfn2表達水平降低而升高，提示Mfn2抑制線粒體中氧化自由基的清除及能量生成，繼而參與先兆子癇發(fā)生發(fā)展的病理機制中[36]。也有研究表明，先兆子癇患者血清中Mfn2水平明顯高于正常組[37]，提示Mfn2在作為先兆子癇分子標志物方面具有一定潛能。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病患者的胎盤中Mfn2表達量也較低，但其具體機制尚不詳[38]。

五、結語

綜上，Mfn家族作為促進線粒體外膜融合的蛋白酶類，調(diào)節(jié)線粒體相關功能，與卵泡發(fā)育、卵子成熟、生殖系統(tǒng)相關疾病和妊娠期子宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)都有密切的聯(lián)系。由此可以推測Mfn對于女性生殖系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)控具有重要意義。現(xiàn)階段關于Mfn的研究主要集中于卵子成熟過程中Mfn對減數(shù)分裂紡錘體及同源染色體分離的影響；關于Mfn1及Mfn2在竇前卵泡向竇卵泡轉(zhuǎn)化過程中的替代關系也值得進一步探索；但現(xiàn)有的關于Mfn的研究尚未闡明其在妊娠期胎盤中的具體調(diào)控機制，從該方面入手研究Mfn對滋養(yǎng)層細胞功能的影響，可以促進對妊娠期相關疾病如先兆子癇、妊娠期糖尿病等診治的完善。研究Mfn對女性生殖系統(tǒng)的調(diào)控作用，可以為女性不孕不育提供一個新的病因?qū)W思路，為輔助生殖技術的發(fā)展奠定一定的理論基礎，繼而促進女性生殖健康。