基因組編輯技術在馬鈴薯精準分子育種中的應用及研究展望

葉明旺 李燦輝 龔明

（1. 云南師范大學生命科學學院 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心 云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，昆明 650500；2. 云南師范大學馬鈴薯科學研究院 云南省高校馬鈴薯生物學重點實驗室，昆明 650500）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界上最重要的塊莖類糧食作物，其在單位土地和時間內所提供的糖類、蛋白質、礦物質以及維生素超過了其他任何作物［1］。除了可以鮮食之外，馬鈴薯還可以通過工業加工成許多商品，如薯片、酒精、淀粉、動物飼料等［2-3］。由于馬鈴薯栽培種絕大多數為四倍體，常規育種方法周期漫長，費時費工。盡管傳統育種方法已經成功育成了許多品種，但是絕大多數馬鈴薯栽培種是高度雜合的同源四倍體，要想將有益突變集中到一個品種當中相當困難，通常育成一個成熟的品種需要十幾年的時間［4］。然而，隨著全球氣候變化、新病原體的出現以及提高馬鈴薯品質、儲藏性、抗逆性等的需要，要求培育出具有理想農藝性狀的馬鈴薯新品種。目前，通過多種分子輔助育種方法來進行馬鈴薯性狀的改良，進而提高產量、加工品質以及儲藏品質等方面已取得了一些進展［5］。隨著馬鈴薯的基因組測序完成［6］，以及基因組編輯技術的迅猛發展，使得馬鈴薯的育種改良進程得以加快，定向設計和精準分子育種成為可能。本課題組在2018年通過CRISPR/Cas9基因組編輯體系對自交不親和的二倍體馬鈴薯S-RNase基因進行了編輯敲除，成功獲得了自交親和的二倍體馬鈴薯突變材料，為后續的二倍體馬鈴薯雜交育種體系建立奠定了重要的基礎［7］。本文簡要綜述了3類主流基因組編輯技術的原理，回顧了基因組編輯技術在馬鈴薯品種改良和精準分子育種中的應用，討論了基因組編輯技術對于馬鈴薯精準分子育種的意義和目前存在的問題，并對基因組編輯技術在馬鈴薯精準分子育種中的應用進行了展望，旨在為該技術在以后的馬鈴薯精準分子育種中的應用提供借鑒和新思路。

1 基因組編輯技術

基因組編輯技術是通過位點特異性核酸酶（Site-specific nucleases，SSNs）對靶位點造成DNA的雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs），從而引發機體的修復機制，修復機制包括兩種：非同源末端連接和同源重組修復［8］。非同源末端連接是一種高效的修復方式，能夠快速在斷口完成修復，但是重復的修復會引入錯配，導致斷裂位點產生缺失或者插入突變；這些突變使得基因的閱讀框發生了變化，進而翻譯出無功能或功能變異的蛋白，從而達到敲除該基因的目的。同源重組修復指的是斷裂位點在修復的時候直接以轉入細胞的與斷裂位點同源的外源片段作為修復模板，使得在斷口位置插入特定的基因或片段［9］。在此基礎上，人們可以對任何已知序列的基因進行敲除以研究其功能，同時也可以對目的基因進行定點修復，使之恢復或者替換基因功能。目前主要用于基因組編輯的有3種SSNs：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs） 以 及 RNA 介 導 的 規律的成簇間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，CRISPR/Cas9）。

1.1 ZFNs

ZFNs是由人工合成的核酸酶，包括了兩個結構域：一個是由多個鋅指結構組成的DNA結合結構域，每個鋅指結構能結合3 bp的DNA序列［10-11］；另一個是由非特異性核酸內切酶FokⅠ組成的DNA斷裂結構域［12］。FokⅠ需要以二聚體的形式才能夠行使斷裂功能［13］，因此需要在靶點兩端單獨設計ZFN，使與之相連的FokⅠ核酸酶能夠在靶點聚集，增加形成二聚體的概率，完成切割DNA雙鏈并引發細胞的修復機制。

早在2001年，Bibikova等［14］就通過人工合成的ZFNs和外源質粒注射到非洲蟾蜍的卵母細胞中，成功獲得了經過切割修復的質粒。隨后，Bibikova等［15］又在果蠅中實現了對Y（yellow）基因進行定向突變，催生了ZFNs在基因組編輯中的應用。ZFNs已被報道應用于一些植物基因組編輯當中，如擬南芥［16］、玉米［17］、大豆［18］等，但未見到以馬鈴薯為材料的報道。

雖然ZFNs能夠大大提高基因的編輯效率，但是由于公開的鋅指模塊較少，構建一個能夠識別特定靶位點的ZFNs需要通過大量的篩選獲得能夠特異結合靶位點的鋅指蛋白。此外，ZFNs對細胞的毒性也限制了該技術的廣泛應用［19］。

1.2 TALENs

人工改造的TALENs和ZFNs原理相似，其斷裂結構域同樣由非特異性核酸內切酶FokⅠ組成；其DNA結合結構域是黃單胞菌入侵植物時所分泌的轉錄激活因子效應物［20］（Transcription activator-like effector，TALEs）。TALEs能夠進入細胞核，結合特定的DNA序列，激活部分基因的表達，增加植物對病毒的敏感性，也有可能引發植物防御機制。TALEs是由多個33-35個氨基酸組成的串聯重復序列組成，每個重復大部分氨基酸的序列是不變的，只有在12/13位的氨基酸（重復可變雙殘基，Repeat-variable diresidues，RVDs）是可變的。含有不同RVDs的重復序列能夠一對一的識別不同的堿基，利用特定的TALEs模塊組合，能夠實現識別任何DNA序列的目的。連接在TALEs上的核酸酶FokⅠ在局部形成二聚體，就能在靶位點進行精確DSBs，實現基因組編輯的目的［21-22］。相對ZFNs來說，TALENs省去了大規模篩選鋅指結構的程序，加大了靶向任何序列的能力，但是實現TALENs模塊的組裝比較費時費力，影響了該技術的大規模推廣。

自2010年以來，TALENs在酵母中完成了對外源質粒的DSBs以及同源重組修復后，該技術已經在一些農作物上進行了應用，如煙草［23］、大豆［24］等。TALENs在馬鈴薯中也有幾個成功的例子，2015年，Nicolia等［25］建立了馬鈴薯原生質體的基因組編輯體系，其編輯效率達到了10%。同樣，TALENs介導的同源重組修復在馬鈴薯中也成功實現，Butler等［26］2016年通過雙生病毒提供了大量的修復模板，成功提高了在馬鈴薯中的同源重組效率。

1.3 CRISPR/Cas9

早在1987年，日本科學家Ishino等［27］在研究大腸桿菌的iap基因的時候，在其側翼發現了一連串由29個堿基組成的串聯重復序列，其間由32個特異堿基間隔開。在之后的研究中發現，這類結構存在于許多的原核生物中［28］。這種結構在2002年被正式命名為CRISPR，其間的間隔特異序列被稱之為Spacer。2005年，Bolotin［29］通過比較嗜熱鏈球菌的CRISPR序列和噬菌體的基因組時發現，噬菌體的序列與Spacer的序列是部分匹配的，同時證實了CRISPR系統與嗜熱鏈球菌抵抗病毒相關?？茖W家們在對CRISPR的進一步研究中發現，細菌可以掃描噬菌體中在序列3’端含有NGG也就是PAM序列的DNA序列并進行切割，然后整合到細菌自身的CRISPR序列當中，形成新的Spacer；當噬菌體再次入侵的時候，CRISPR序列轉錄成CRISPR RNA，經加工成熟后與Cas蛋白結合，引導Cas蛋白切割與之匹配的噬菌體DNA序列，達到防御的目的。

CRISPR根據基因的保守性和組織排列特異性分為3種類型：I型和III型需要6到7種蛋白質才能發揮作用，目前通常用的是II型的CRISPR，只需要一種Cas9蛋白就能發揮作用［30］。2012年，Jinek等［31］首先構建了CRISPR/Cas9載體，完成了環狀DNA以及線性化DNA的體外切割。該系統主要含有兩部分：Cas9蛋白以及導向靶基因的單鏈引導RNA（Single guide RNA，sgRNA）。因為潛在的靶點很多，以及載體構建方便，CRISPR/Cas9系統開始大規模應用于各種生物的研究。

目前，CRIPSR/Cas9系統已經成功應用于多種植物基因組編輯上［32］。在馬鈴薯中，Butler 等［33］利用CRISPR/Cas9系統分別對二倍體和四倍體馬鈴薯的乙酰乳酸合成酶基因（Acetolactate synthase1，StALS1）進行了敲除，其中突變效率最高達到了60%。Hiroaki等［34］利用水稻的OsMac3的翻譯增強子插入到啟動子和Cas9基因之間，能夠明顯增加馬鈴薯等位基因的突變效率。Nadakuduti等［35］還對比了CRISPR/Cas9和TALENs在馬鈴薯原生質體中的突變效率，研究表明Cas9的編輯效率（27.4%）明顯高于TALENs的編輯效率（12.6%）。另外，Veillet等［36］通過胞嘧啶單堿基核苷酸編輯使StALS1突變，使馬鈴薯獲得了除草劑抗性，結合農桿菌侵染方法，從而獲得不含外源DNA片段的基因組編輯植株。

2 基因組編輯在馬鈴薯品種改良和精準分子育種中的應用

2.1 降低馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿含量

糖苷生物堿（Steroidal glycoalkaloids，SGAs）是一種存在于馬鈴薯中的有毒物質［37］，是影響馬鈴薯品質的重要性狀。在馬鈴薯育種過程中，通過與野生種馬鈴薯雜交，能夠帶來一些優異的抗病性狀，但同時也會提高SGAs的含量［38］，所以控制SGAs的含量對于馬鈴薯育種來說是非常重要的。

甾醇側鏈還原酶2（SSR2）是合成膽固醇的關鍵酶，與SGAs的合成密切相關。Sawai等［39］首先通過RNAi技術對馬鈴薯的StSSR2進行干涉，在StSSR2轉錄本顯著降低的轉基因植株中，SGAs的含量無論在試管苗或是塊莖皮中都低于非轉基因的10%以下，且膽固醇的含量也顯著降低。同時，下調StSSR2的表達量并不會影響薯塊的產量。然后通過TALENs載體在StSSR2上引入突變，獲得的突變體中SGAs的含量同樣下降到野生型的10%左右。利用這種人工創制的低SGAs的馬鈴薯材料，能夠加速低SGAs品種定向改良及精準育種的進程。此外，在龍葵堿合成通路中，還有一個2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（2-oxoglutaratedependent dioxygenase，16DOX）基因，在RNAi植株中被證實能夠強烈抑制SGAs的產生［40］，同時不會影響馬鈴薯的產量。隨后，Nakayasu等［41］利用CRISPR/Cas9基因組編輯體系在馬鈴薯根中對St16DOX進行了敲除，之后對轉基因植株進行檢測，發現在St16DOX不能正常表達的植株當中SGAs的含量幾乎為零。因此，St16DOX能夠成為創制不含SGAs的馬鈴薯品種潛在的基因組編輯位點。顯然，經過多組學手段，進一步弄清馬鈴薯SGAs的詳細代謝途徑及關鍵調控酶基因，而后通過基因組編輯技術，可為降低馬鈴薯塊莖SGAs含量的精準分子育種提供一條強有力而快捷的技術實現途徑。

2.2 改良低溫儲藏馬鈴薯塊莖的品質

為了延長馬鈴薯的儲藏時間，生產上一般都會采取冷藏的方式，但是冷藏會導致馬鈴薯的蔗糖大量裂解產生還原糖，使得馬鈴薯在高溫加工時產生黑色苦味產物，降低品質［42-44］。還原糖還能夠與游離氨基酸如天冬酰胺反應生成致癌物質丙烯酰胺［45］。所以在冷藏馬鈴薯中，還原糖的含量是一個很重要的指標。

液泡轉化酶（VInv）定位在液泡中，在低溫冷藏馬鈴薯產生還原糖中扮演著重要的角色［46］，通過RNAi下調StVlnv的表達能夠顯著降低薯塊中的還原糖濃度，使得薯片中丙烯酰胺的含量下降到野生型薯片的1/15。之后，Clasen等［47］通過PEG介導，把包含靶向StVlnv的TALENs載體導入馬鈴薯原生質體中，成功獲得了StVlnv敲除的再生植株。在4個等位基因都突變的冷藏馬鈴薯當中，葡萄糖和果糖的含量低于該實驗的極限檢測值（＜0.1 mg/g），同時蔗糖的含量明顯上升。在StVlnv敲除的冷藏馬鈴薯加工成薯片之后，其中丙烯酰胺的含量相較于野生型的下降了73.3%，且薯片的顏色明顯要優于野生型的薯片。這為解決冷藏馬鈴薯的品質變差提供了很好的解決方法。

2.3 修改馬鈴薯塊莖中的淀粉組成成分

馬鈴薯淀粉在食品和工業上都有著非常廣泛的應用。通?？梢酝ㄟ^化學或者物理的方式來改變淀粉的性質，但是這些手段或多或少都會影響環境［48］。所以，如果在馬鈴薯塊莖中能夠直接完成淀粉合成特性的轉變將會非常有應用價值。淀粉有兩種組成成分：直鏈淀粉和支鏈淀粉。其中，馬鈴薯中含有一個合成直鏈淀粉關鍵的酶：顆粒結合淀粉合成酶（GBSS1）。高支鏈淀粉馬鈴薯（蠟質馬鈴薯）已經通過RNAi技術干涉StGBSS1成功實現［49］。隨后，Andersson等［50］通過在四倍體馬鈴薯中瞬時表達靶向StGBSS1的CRISPR/Cas9編輯載體，使得該基因的4個等位基因全部突變，實現了馬鈴薯中合成的淀粉全部成為支鏈淀粉，并且沒有任何外源DNA片段插入馬鈴薯基因組的情況，這為定向改變馬鈴薯塊莖中的淀粉組成成分，進而為特定食品和工業用途的馬鈴薯品種的精準分子育種提供了一個很好的范例。

2.4 改變馬鈴薯自交不親和性

目前，栽培種馬鈴薯都是四倍體，一個馬鈴薯品種要育成每個顯性抗病基因存在3個或者4個等位基因的話，可能需要時間長達15年［51］，這對于馬鈴薯的品種改良是很不利的。而如果用二倍體馬鈴薯的的近交系進行雜交育種的話可能是一個高效的育種方式［4，52］。但是二倍體馬鈴薯存在著自交不親和（Self-incompatibility，SI）現象。馬鈴薯中，自交不親和由高多態性的S位點所控制，在野生馬鈴薯Solanum chacoense中含有顯性的S位點抑制基因（Sli），能夠實現馬鈴薯的自交［53］。但是，導入該基因會使得S. chacoense中的一系列未馴化位點，如長匍匐莖、高龍葵堿等帶入到育種材料中，增加篩選的工作量［38，54］。本課題組在2018年，通過轉錄組測序獲得了控制二倍體馬鈴薯自交不親和的雌蕊決定基因S-RNase序列全長，之后通過CRISPR/Cas9基因組編輯體系，對該基因進行了編輯，成功獲得了S-RNase雙等位基因突變的且自交親和的二倍體馬鈴薯材料［7］。該研究開辟了二倍體馬鈴薯育種的新途徑，拓展了自交親和馬鈴薯資源，將加速馬鈴薯的遺傳改良［55］。不久之后，Enciso-Rodriguez等［56］也對S-RNase進行敲除，同樣獲得了能夠自交親和的二倍體馬鈴薯，進一步證實了對S-RNase的編輯能夠獲得自交親和的二倍體馬鈴薯材料。

3 展望

基因組編輯技術效率高，可對靶標基因進行定點敲除、插入、替換等，是非常實用的基因功能研究以及精準分子育種工具，已成為農作物改良的重要技術。目前基因組編輯技術在重要農作物如水稻、小麥、玉米等基因功能驗證及定向遺傳改良方面已有許多成功的案例，但是在馬鈴薯定向遺傳改良方面的成功運用尚還有限。

馬鈴薯栽培品種通常是高度雜合的同源四倍體，遺傳背景復雜，涉及到產量、品質、抗性等許多重要農藝性狀的重要代謝途徑和關鍵控制基因尚不清楚，進而或為通過基因組編輯來進行馬鈴薯精準分子育種的核心限制因素。因此，通過多組學聯合分析，弄清控制馬鈴薯重要農藝性狀的代謝途徑和闡明關鍵控制基因的功能，將會為基因組編輯技術運用于馬鈴薯精準分子育種奠定堅實的基礎。

此外，基因組編輯技術用于改良重要農作物對生物和非生物脅迫抗性已有不少成功的案例［57-58］，但在馬鈴薯方面尚未見到報道。馬鈴薯晚疫病是公認的對馬鈴薯最嚴重的病害，能夠在感染后10 d完全摧毀馬鈴薯植株［59］。Oliva等［60］在水稻上已經通過基因組編輯技術編輯了感病基因（Susceptible gene）SWEET11、SWEET 13和SWEET 14的啟動子的EBE結合元件，進而提高了水稻對細菌性白葉枯病廣泛的抵抗力。而在馬鈴薯上同樣存在著許多S基因，如StUBK［61］、StBSL家族基因［62］和StVIK［63］等，沉默這些基因能夠獲得抗病性增強的表型?？梢酝茰y，利用基因組編輯技術能夠使得這些S基因應用于馬鈴薯抗晚疫病的精準分子育種，這將會是一個很有前景的研究方向。

因馬鈴薯品種的原因，很多品種的馬鈴薯遺傳轉化體系建立起來比較困難［64］，使得一部分品種的馬鈴薯難以獲得所需要的轉基因植株；此外，由于目前轉基因作物在公眾中的接受程度不高，想要推廣基因組編輯馬鈴薯最好在完成編輯的馬鈴薯中不含外源DNA片段。對于含有外源片段的基因組編輯植株來說，想要去除轉基因植株的外源片段，可以通過自交的方式進行篩選［7，56］。另外，也可以通過載體在馬鈴薯原生質體中瞬時編輯來達到不含外源DNA片段的目的。但是，馬鈴薯的原生質體游離以及再生過程十分繁瑣，耗費時間長達6-7個月［25］。因此，進一步改良和完善基因組編輯技術，以獲得不含外源DNA片段的無轉基因且能穩定遺傳的基因組編輯馬鈴薯品種，這將會具有很大的應用價值。

CRISPR/Cas9基因組編輯體系因其結構簡單且編輯效率高，在3種基因組編輯工具中應用最為廣泛，但是其對于靶位點的識別可以容忍幾個堿基對的不匹配，這意味著某些靶位點可能存在著數千的潛在脫靶位點，所以會造成脫靶現象，進而對細胞產生遺傳損害作用［65-67］。Upadhyay等［68］通過對小麥的肌醇加氧酶基因（Inositol oxygenase，INOX），八氫番茄紅素基因（Phytoene desaturase，PDS）的靶位點進行了篩選，發現在gRNA的近5'部分不匹配并不會完全破壞Cas9的編輯效率。Xie等［69］通過對水稻的PS3基因進行編輯時，對11個潛在的脫靶位點進行了分析，發現了一個被成功編輯的潛在脫靶位點。這對于CRISPR/Cas9應用于作物精準分子育種是非常不利的。目前主要有3種降低脫靶率的方法：一是改變野生型的Cas9酶活性中心的關鍵催化殘基，使其由內切酶轉化為切口酶，在靶位點使用兩個毗鄰的gRNA，能夠顯著的降低脫靶效應且不損壞其編輯效率［70-71］；而在單堿基突變的體系當中，Zhou等［72］通過把腺嘌呤編輯器（Adenine base editors7.10，ABE7.10）中的腺嘌呤脫氫酶148位的脯氨酸置換為精氨酸后，能夠完全去除對RNA的脫靶效應，且并不會降低對靶位點DNA的編輯效率。二是通過在gRNA的5'縮短2-3 bp，同樣能夠降低脫靶效應［73］。三是通過在線工具如（http：//cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/）來指導設計靶位點，達到降低脫靶效應的目的［74］。Xie等［75］對幾個重要的模式作物以及農作物的全基因組進行了分析，發現含有特異性的gRNA的轉錄單元數量達到了83.4%-98.6%。因此，大部分基因都可以通過精心挑選靶位點，來避免脫靶效應。另外，Cas9蛋白在細胞內的持續表達也會對細胞造成持續的損傷，Jiang等［76］對萊茵衣藻進行研究，發現Cas9蛋白的持續表達能夠對萊茵衣藻產生毒害作用。在人體細胞中，通過注射gRNA和Cas9蛋白可以顯著的降低Cas9蛋白對細胞造成的毒害作用［77］。目前，Cas9蛋白在馬鈴薯中的持續表達所造成的細胞毒害以及解決方法尚未見到報道。這就需要大量的實驗來論證并克服Cas9蛋白對馬鈴薯的毒害作用，為基因組編輯技術應用于馬鈴薯的精準分子育種提供支撐。

總之，基因組編輯技術將會給馬鈴薯的精準分子育種提供一個重要的技術解決手段，使馬鈴薯的重要農藝性狀如低SGAs含量、營養與品質、風味、對生物和非生物脅迫的抗性等得以進行精準的定向遺傳改良。目前需要通過多組學手段，全面解析控制馬鈴薯重要農藝性狀的代謝途徑和關鍵基因，進一步開發精準高效的基因組編輯技術，并與常規育種方法相結合，以最終育成更多性狀優良的馬鈴薯品種。