CRISPR技術在生物學與醫學中的研究進展

楊悅 高郡茹 楊柳

（1. 廣西師范大學生物醫學研究中心，桂林 541004；2. 廣西師范大學干細胞與醫藥生物技術重點實驗室，桂林 541004；3. 廣西師范大學生命科學學院，桂林 541004）

1 CRISPR技術簡介

CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associate）是微生物體內基于RNA介導的核酸酶切割清除外源核酸的適應性免疫系統［1］。與人體自身的免疫系統相似，微生物體內的免疫需要經歷適應（感染）→表達（防御/切割）→插入（記憶）3個過程［2］。這3個過程主要由CRISPR系統完成，其中“表達”過程中會產生多種Cas蛋白。Cas1和Cas2負責將外源基因整合到CRISPR陣列中，Cas4負責對外源基因形成免疫記憶［3］，Cas9則在RNA引導下對外源核酸進行切割。根據Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系統可分為5類，I、III和IV型系統均需要借助復雜的蛋白復合體，而II和V型系統僅需要RNA和Cas蛋白。大多數CRISPR系統都依賴于鄰近crRNA靶向位點的PAM（Protospacer adjacent motif）序列，缺失PAM序列將會導致CRISPR系統的自我切割［3］。

基因編輯中最常用的CRISPR/Cas9屬于II型CRISPR系統，由Cas9蛋白和特異性選擇CRISPR RNA（crRNA）和輔助反式激活crRNA（tracrRNA）組成［4］。其中crRNA與tracRNA的結合體可被重新設計為包含Cas9結合和DNA靶位點特異性識別的單個轉錄物（single-guide RNA，sgRNA），在sgRNA協助下，Cas9蛋白可切割DNA上可被引物RNA識別并包含PAM（NGG序列）序列的位點［5］。相較于第一、二代基因編輯技術——ZFN和TALEN，CRISPR操作簡便，設計簡單，識別不受基因組甲基化的影響，近乎可以靶向任意細胞的任意序列，同時靶向多個位點，編輯效率更高。

2 CRISPR系統的改造與開發

2.1 DNA編輯

目前較成熟的兩種CRISPR系統為II型Cas9和V型Cpf1（原Cas12a）。2018年2月，David Liu實驗室利用PACE（Phage-assisted continuous evolution）技術對spCas9蛋白進行快速進化和篩選，獲得了PAM序列兼容性更高、脫靶率更低的spCas9變體，命名為 xCas9 3.7［6］。相對之前的 spCas9，xCas9 3.7不僅具有更高的DNA特異性，且在所有NGG靶向測試中的脫靶率更低，在非NGG PAM靶向測試中也有著極低的脫靶率。這一發現打破了之前對Cas9的編輯效率、PAM序列兼容性和DNA靶向精確性三者之間相互制衡的認知，擴大了CRISPR系統的DNA靶向范圍，提高了基因編輯的準確性和靈活性。此外，中科院動物研究所李偉研究組在酸性脂環酸芽孢桿菌中發現了另一種 Cas12b（AaCas12b）［7］。雖然AaCas12b的RuvC結構域與Cas9和Cas12a相似，但其推定的Nuc結構域與Cas9的HNH結構域和Cas12a的Nuc結構域沒有序列或結構相似性。相較于spCas9和Cfp1，AaCas12b具有尺寸更小、適用于包裝腺病毒、能識別更簡單的PAM序列、在人類血漿中穩定性增強、脫靶效應最低、特異性高等特點。相較Cas12b的最佳剪切溫度（40-55℃），AaCas12b的最適活性溫度為31-59℃，更適應用于哺乳動物細胞的基因編輯。

2018年 10月，Doudna團隊［8］發現了一套來自野生型古生菌的CRISPR/Cas系統，其中包含Cas14—一個異常緊湊的RNA引導的核酸家族［8］。對比分子較大的Cas9蛋白（950-1 400 aa），Cas14a蛋白的分子量更小（400-700 aa），并能在RNA介導下對無限制性序列的單鏈DNA進行靶向切割。Cas14蛋白的小尺寸及其與V型Cas蛋白的相似性表明RNA介導的ssDNA切割可能先于第二類CRISPR系統出現，且可能第二類CRISPR系統正是由其發展而來。Cas14的發現證實了微生物體內CRISPR系統的多樣性，同為CRISPR系統，Cas9和Cpf1等主要作用于dsDNA，而Cas14等主要作用于ssDNA，為微生物抵抗外源病毒的侵襲提供了多樣的免疫方式。對此類微生物的進一步探索有助于加強對微生物免疫“軍備競賽”的了解，也為發現更多有價值的CRISPR系統提供了線索。

2019年1月，Doudna團隊［9］揭示了新型基因編輯工具CRISPR/CasX的潛在機制，該工具使用獨特的結構進行可編程的雙鏈DNA結合和切割。生化分析和細胞內實驗表明CasX對大腸桿菌和人類的基因組具有修飾活性。CasX蛋白的結構和大小以及最小的反式切割活性表明這是一個與Cas9和Cas12a完全不同的、全新的Cas蛋白家族。研究證明，CasX是一種由RNA介導的DNA核酸內切酶，可在sgRNA介導下對雙鏈DNA進行切割。CasX蛋白大小緊湊，不到1 000 aa，更容易包裝入AAV病毒，為基因治療的體內遞送提供了更高效的可能性；且CasX來源自非病原微生物，因此也更安全。

2016年，David實驗室［10］利用失活的Cas蛋白與APOBEC1（胞苷脫氨酶1）共表達，開發了單堿基編輯系統（Base Editor，BE），可在不對DNA雙鏈進行切割的條件下完成單堿基（C→T）的永久突變。這種單堿基編輯系統中的dCas9保留了其在sgRNA介導下定位到DNA靶位點的能力，但不會對DNA雙鏈進行剪切，共表達的胞苷脫氨酶將目標胞苷直接轉化為尿苷，然后利用體內的DNA修復機制將尿嘧啶永久轉化為胸腺嘧啶。由于體內尿嘧啶糖基化酶的作用，第一代BE的編輯效率較低。研究者在其基礎上融合了尿嘧啶糖基化酶抑制劑，開發出第二代BE，進而融合了針對未編輯鏈的Cas9切口酶，以促進DNA的修復反應，形成第三代BE。在進一步的實驗中，研究人員通過篩選融合不同突變型的胞苷脫氨酶，將BE3的編輯窗口由5個縮窄至1-2個，并能夠區分相鄰的胞嘧啶，使之優先糾正與疾病相關的目標胞嘧啶的效率增加一倍［11］。經過實踐觀察，2017年，實驗者在BE3的基礎上融合共表達噬菌體Mu蛋白Gam，開發出BE4［12］。實驗證明，BE4的編輯效率較BE3提升50%，且由于Gam能夠與DSB結合，錯配率進一步降低，編輯副產物減少一半。

BE系統中的dCas9主要識別的PAM序列為NGG形式，使之在富T序列中的編輯效率較低。針對此類問題，上海科技大學的陳佳團隊構建了以CRISPR/Cpf1為基礎的單堿基編輯系統［13］。Cpf1蛋白可識別富含A/T的PAM序列，結合了Cpf1的單堿基編輯系統在A/T富集區域亦可實現編輯作用，在擴展了可編輯范圍的同時，產生的編輯副產物也較低，因此具有更高的編輯精確度。這種單堿基編輯器可與BE系統實現堿基編輯的有效互補。由于BE系統僅在C→T堿基編輯中有較高效率，而A→G堿基編輯效率低。因此，David Liu團隊將一種RNA腺苷脫氨酶與dCas9融合共表達，開發了腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor，ABEs）［14］。ABEs系統與BE系統原理相似，在RNA腺苷脫氨酶作用下將目標腺嘌呤脫氨形成肌苷，再在聚合酶作用下轉化為鳥嘌呤。與BE系統相比，ABEs系統引入點突變的效率更高、錯配率低、編輯產物純度更高、副產物更少、對非靶基因的影響也更少［14］。

2.2 RNA編輯

相關研究發現CRISPR/Cas13a能夠切割細菌的特定RNA序列。Doudna團隊亦報道證實，CRISPR/Cas13a可用于RNA檢測［15］。2017年10月，張鋒實驗室首先證實CRISPR/Cas13a可靶向編輯哺乳動物體內RNA。比起RNAi，Cas13a有著更強的特異性，并且由于其對哺乳動物細胞而言是非內源性的，因此擾亂細胞中天然的轉錄后網絡的可能性極低［16］。Hsu團隊通過生化表征和蛋白質工程對7種不同的直系同源物進行分析篩選出Rosenococcus flavefaciens的 XPD3002（CasRx）［17］。并利用 HEPN 結構失活的dCasRx靶向剪切前mRNA順式元件，在額顳葉癡呆神經元模型中成功糾正了失調的tau蛋白異構體比例。由于CasRx的尺寸較小，更易包裝入病毒載體應用于治療。且相較于傳統的RNA干擾技術，CasRx擁有較高的剪輯效率和精確性，不易產生明顯的脫靶效應。據研究估計，RNA拼接錯誤疾病占遺傳疾病的15%［18］。CasRx等RNA編輯蛋白的出現展現出了其在RNA多重靶向上的潛力。此外，靶向AAV遞送CasRx至特定的有絲分裂后細胞類型（如神經元）中，則具有介導糾正單元的長期表達的潛力，避免了永久性遺傳修飾或糾正技術的頻繁施用，對其他核酸靶向技術進行了補足，使核酸編輯技術得到了極大的擴展［17］。

2.3 CRISPR的負面效應

CRISPR技術發展迅速，然而其對目標DNA的匹配有一定的容忍度，即可允許個別堿基的錯配，這一特點導致Cas蛋白也會切割與目標DNA有較少堿基差別的非目標DNA，這一現象被稱為脫靶效應［19］。脫靶效應是CRISPR技術臨床應用的最大挑戰。除此之外，也有研究顯示，CRISPR/Cas9系統似乎在編輯p53基因突變的細胞時擁有更高的編輯效率［20］，而作為已知最重要的抑癌基因之一，p53的突變會使細胞癌變的風險增高［21］。更嚴重的是，法國波爾多大學的研究人員發現，利用CRISPR/Cas9系統進行基因組編輯會誘導出現百萬堿基規模的染色體大片缺失，而這種缺失，比起脫靶效應更為嚴重［22］。還有研究顯示，當被CRISPR/Cas9編輯后的細胞進行自身修復時，會在靶位點出現的大片缺失和更復雜的基因重排［23］。在此之前，對所有CRISPR基因編輯結果的分析，通常只關注靶點的鄰近序列以及遠端的脫靶序列周圍很小的部分，并由此得出的CRISPR-Cas9精確特異性的結論。通過長讀取測序和長鏈PCR基因分型顯示，sgRNA/Cas9介導的DNA斷裂會導致許多一千以上堿基的缺失。此外，還發現了切割位點遠端的突變和交叉事件［23］。在臨床同時編輯數十億細胞的情況下，產生的大量突變可能導致每例治療方案中一個或多個細胞攜帶致命突變。進而導致癌變和腫瘤的形成。不過幸運的是，Kim等［24］開發的用于體外檢測CRISPR脫靶效應的工具——Digenome-seq的檢測結果和高彩霞團隊［25］的研究均顯示，經過精準設計的sgRNA介導的CRISPR/Cas9系統脫靶率極低。

比起經典的CRISPR/Cas9系統，BE系統擁有諸多優點，且已有研究者在治療遺傳性疾病中利用該系統取得了一定的治療成果［26-27］。然而，中科院遺傳與發育研究所的高彩霞研究組通過對BE3、HF1-BE3與ABE單堿基編輯器的特異性進行全基因組水平評估，全面分析比較了這3種單堿基編輯器系統在基因組水平上的的脫靶效應。結果表明，無論是否有sgRNA的引導，BE3和HF1-BE3均可在水稻基因組中造成大量的單核苷酸變異（SNVs），且大部分為C＞T類型的堿基突變［25］。同時，楊輝團隊建立了一種命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術，并用該技術檢測單堿基編輯的脫靶效應，得到了與前者一致的結果［28］。GOTI的檢測顯示，BE3的脫靶效應非常嚴重，但之所以之前的方法一直未能發現這一問題，是因為這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現的脫靶位點，進一步分析發現，脫靶位點有部分出現在原癌基因和抑癌基因上，介于此類隱患，研究者認為BE3并不適合作為臨床治療工具［28］。雖然CBE系統的脫靶效應令人擔憂，值得欣慰的是，不論是高彩霞研究組的研究還是GOTI的檢測，都顯示ABE系統依舊擁有極高的特異性。但也有研究認為ABE系統并不如想象中的那么保險，經中山大學研究團隊開發的首個檢測ABE系統全基因組范圍內脫靶效應的方法——EndoV-seq檢測顯示，ABE系統雖然特異性非常高，但仍然具有脫靶效應［29］。而Jin-Soo Kim的研究則顯示，ABE系統的脫靶效應雖低于Cas9，卻高于BE3［30］。

具備無需DNA雙鏈斷裂和極低的錯配率等優點，單堿基編輯系統的高效性和低風險性使其在單點突變導致的遺傳病的治療中擁有極大地應用潛力。但基于上述研究，單堿基編輯系統在投入臨床之前還需要進行進一步的風險評估，應通過優化sgRNA序列、CRISPR核酸復合物遞送和優化Cas9蛋白等方式［30］提升CBE和ABE系統的精確性。并且在利用CRISPR技術進行臨床應用之前，對患者細胞進行全面基因組分析，確定其具有正常的基因組，以降低治療風險［23］。

3 CRISPR技術應用進展

3.1 構建模型生物

2017年3月，韓國基礎科學研究所的研究人員利用CRISPR技術成功構建單核苷酸編輯小鼠［31］。IBS的研究人員使用BE技術在小鼠胚胎中高效誘導堿基替換，從而培育出具有疾病表型的小鼠，為囊性纖維化、鐮刀形紅細胞貧血癥、苯丙酮尿癥等單堿基突變引起的疾病提供了有效模型。2018年3月，暨南大學李曉江課題組利用CRISPR技術成功建立亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬模型［32］。作為神經退行性疾病研究領域的里程碑式的發現，亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬的建立為深入了解神經細胞死亡的機制及尋找有效的理療方法提供了極佳的動物模型。2019年2月，李曉江課題組再次利用CRISPR技術成功構建了PINK1基因突變的帕金森恒河猴模型［33］。PINK1突變猴中觀察到的顯著神經元丟失未在PINK1敲除小鼠或豬模型中報告，而這一現象可能與PINK1在靈長類動物體內的特異性表達和功能有關。PINK1突變猴的構建揭示了PINK1在靈長類大腦中的關鍵功能，并將提供一個新的研究PINK1的多種功能和與PINK1功能障礙相關的發病機制的工具［33］。

3.2 監測活細胞內反應進程

科學家們一直致力于尋找一種可觀察和記錄細胞生命活動的方法但收效甚微。2017年12月，哥倫比亞大學的研究人員將CRISPR改造成“錄音筆”以記錄生物體內轉瞬即逝的生理信號［34］。長期以來，人們大多關注于CRISPR強大的基因編輯功能，而忽略了其原本是一種來源于細菌的免疫機制。在細菌里，CRISPR-Cas系統能把外來病毒的DNA片段切斷，并整合到自己的CRISPR位點中，形成免疫記憶。因此，當再有同樣的病毒入侵時，細菌就能根據CRISPR位點中的免疫記憶快速地、有針對性地啟動防御。基于該原理，研究者構建了兩種質粒，一種質粒能夠對外來的特性生理信號做出反應，并隨之擴增；另一種質粒則能表達CRISPRCas系統元件。根據設想，當沒有外來生理信號出現時，CRISPR表達質粒會不斷地向細菌的CRISPR位點插入空白序列；當有外來信號出現時，前一種質粒就會啟動并擴增，在CRISPR位點上留下印記。經過一段時間后，對細菌的CRISPR位點進行測序和分析，就能知道是否有監控所需的生理信號。根據印記所在位置還能夠反推該信號產生的時間。這一設想已通過實驗得到驗證，研究者表示，這套系統在大腸桿菌中可以同時記錄了三種不同的生理信號，并持續記錄數天。2018年2月，美國布羅德研究所的Weixin Tang和David R. Liu共同開發出一種稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multievent recording apparatus）的CRISPR介導的模擬多時間記錄裝置，并利用這種技術構建出兩種類型的細胞記錄系統——CAMERA 1和CAMERA 2［35］。在CAMERA 1中，研究人員將兩種不同的質粒注入細菌細胞中，在刺激物誘導下，利用CRISPR Cas9切割其中一種質粒，以誘導細胞產生另一種質粒來取代之前的質粒，由此完成對整個事件進行記錄。這種記錄系統能夠幫助研究人員記錄細胞如何對營養物或抗生素等刺激物做出反應。而在CAMERA 2中，當所需的信號在細胞中發生時，研究人員利用堿基編輯器改變遺傳密碼中的單個堿基。由此可記錄當細胞接觸病毒、營養物和抗生素等刺激物時，細胞如何作出反應。據報道稱，研究人員已將該技術成功應用于細菌細胞和人細胞中。此外，2018年4月，Spanjaard等［36］開發了利用CRISPR技術誘導的DNA瘢痕序列追蹤細胞譜系的技術，并命名為 LINNAEUS（Lineage tracing by nuclease-activated editing of ubiquitous sequence，通過對普遍存在的序列進行核酸酶激活的編輯來開展譜系追蹤）。這種技術基于DNA中的瘢痕序列，當這些瘢痕序列匯總在一起時就像條形碼一樣，能夠確定細胞的譜系。

3.3 疾病檢測及治療

CRISPR技術同樣可以用于癌癥、遺傳病、AIDS等疾病的檢測和治療。2017年11月，弗吉尼亞聯邦大學的研究人員將HS-AFM（高速原子力顯微鏡）與一種基于CRISPR的化學條形碼技術結合起來，開發出了一種新的納米繪圖技術［37］。他們用Cas9-sgRNA復合物標記目標DNA，然后用HS-AFM對目標DNA成像并測定DNA上的標記。由此可對腫瘤細胞中突變基因進行精確定位并分析。由于該技術的要求設備占地小，且可直接用DVD光學元件檢測成像，因此有望在醫院和實驗室中得到普及。2018年4月，來自斯坦福大學的科學家發現了一種修飾肺癌小鼠肺部的一對癌癥相關基因的新方法，之后還能精確地追蹤腫瘤中的每一個細胞［38］。他們將CRISPR/Cas9與DNA條形碼技術相結合開發出了組合性技術，以此來追蹤癌癥的生長發展情況。這種技術能幫助研究者在實驗室中復制出在癌癥患者體內所觀察到的腫瘤的遺傳多樣性，也有助于研究者克服在研究癌癥復雜性中產生的畏難情緒。2017年2月，美國斯隆—凱特琳癌癥中心的研究人員使用腺相關病毒（AAV）介導，將CRISPR/Cas9技術應用于CAR-T療法［39］。研究者利用CRISPR/Cas9技術構建出更加強效的嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor CAR）T細胞（CAR-T細胞），從而增強小鼠體內的腫瘤免疫排斥。這一發現揭示出CAR免疫療法的一些細節，并且突出展現了利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術推動癌癥免疫療法的潛力。該研究避免了傳統CAR-T療法的隨機整合可能存在的潛在危害，也極大地降低了CAR-T細胞發生分化或癌變的風險。

2019年2月，Natrue Medicine上發表了針對早衰癥和杜氏肌營養不良癥的CRISPR基因治療成果。早衰癥是由于LMNA基因發生突變，導致一個選擇性前體mRNA（pre-mRNA）剪接位點被激活，并表達progerin（一種缺失50個氨基酸的lamin A蛋白突變體）引發的一種遺傳病。Progerin在核膜上的積累會損害核結構的完整性、異染色質維持、DNA修復和氧化還原穩態，并促進細胞衰老。針對早衰癥的致病機理，西班牙和美國的研究團隊［40］開發了相應的CRISPR/Cas9治療策略——通過破壞LMNA基因的最后部分，在不影響lamin C表達的情況下，阻礙lamin A/progerin的生成。出于安全性和廣泛的組織親和性，研究者選擇AAV 9作為遞送載體，分別通過腹腔注射或靜脈注射注入早衰癥小鼠模型。實驗結果表明，與對照組小鼠相比，經過CRISPR/Cas9治療的小鼠中的progerin蛋白顯著減少，平均壽命延長25%以上。杜氏肌營養不良癥是一種發病率相對較高的，由X染色體上編碼抗肌萎縮蛋白基因（Dystrophin）突變所致的單基因疾病。Gersbach團隊通過CRISPR技術直接刪除dystrophin基因突變位點附近的堿基，使之表達縮短版的抗肌萎縮蛋白，以此恢復部分肌肉能力［41］。實驗結果表明，通過靜脈單次注射AAV 8裝載的CRISPR后，基因組編輯效果在肌營養不良癥小鼠模型體內可持續長達一年的時間，且在此間抗肌萎縮蛋白表達的恢復得以維持［41］。

2018年4月，郭斐團隊報道稱，已使用CRISPR/Cas9技術成功抑制了艾滋病病毒HIV-1的多個感染步驟［42］。研究者在文章中進一步探討了CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染的分子機制——Cas9不僅在病毒DNA中導致插入缺失，并且降低了晚期病毒DNA產物和整合病毒DNA的水平。實驗還表明，只有當Cas9存在于細胞質中時，才能對新合成的HIV-1 DNA進行編輯，并抑制病毒的感染。

4 小結

伴隨著CRISPR技術在生物醫學等領域的廣泛使用，并與多種傳統的研究技術相結合，其在癌癥的治療和遺傳性疾病方面的應用取得多項喜人的研究成果。而同時，雖然相較于第一代和第二代基因編輯技術，CRISPR技術在精確性和特異性上均有極大提升且更易操作，但脫靶效應仍是其大規模應用于基因治療的主要掣肘，因此，如何降低脫靶率，提高精確性、特異性和穩定性依然是CRISPR技術急需解決的問題。盡管如此，作為具備眾多優點的新一代基因編輯技術，CRISPR技術在科學研究中的發展應用依然值得我們期待。