動物轉基因高效表達策略研究進展

趙旭東 黃永志 畢延震 董發明

（1. 河南科技大學動物科技學院，洛陽 471023；2. 動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430064）

當今，動物轉基因技術主要應用于動物遺傳改良、培育動物新品種、制造生物反應器、建立疾病模型和器官移植等［1-4］，部分動物轉基因產品已經實現了商業化開發。如在2015年美國FDA批準了轉基因三文魚上市，成為世界上首個獲批可用作食材的轉基因動物［5］。目前，動物轉基因遇到的瓶頸是外源基因表達沉默。其原因主要集中在以下兩個方面：染色體DNA水平上的位置效應［6］和外源基因表觀修飾異常。近些年，隨著定點整合技術的飛速發展和友好位點的開發與應用，克服外源基因表達沉默有了新的解決方案。為此，本文對動物轉基因高效表達策略進行了歸納和論述，以期對轉基因動物研制和推廣有所裨益。

1 利用友好位點

當前，基因編輯技術的發展使外源基因定點敲入變得相對簡單且高效，但不能忽視的是外源基因依然面臨著敲入到何處的難題，這是因為基因敲入的區域不同，將直接造成基因表達的效率差異。友好位點就是基因組中表達外源基因較為活躍的區域。因此，利用定點整合技術將外源基因插入至友好位點將是解決外源基因表達沉默的有效途徑。友好位點的探索、挖掘與驗證工作，已歷經了長達20多年之久，在哺乳動物中已成功鑒定出多個可行的友好位點。例如，Rosa26、Hipp11、chr1-attP等位點。

1.1 Rosa26位點

Rosa26位點是一種最常用的友好位點，已經廣泛應用在以小鼠、大鼠、豬等為實驗對象的研究之中［7-9］。 早 在 1991 年 Friedrich 和 Soeiano［10-11］使用逆轉錄捕獲技術在小鼠基因組中率先發現并鑒定出Rosa26位點。他們設計一個報告基因 β-geo（由β-半乳糖（β-gal）和新霉素磷酸轉移酶（neo）形成的融合基因），利用該報告基因載體共篩選出了29個陽性單克隆ES細胞。后分析發現代號為ROSAβgeo26小鼠品系的純合子和雜合子小鼠均無任何異常表型，報告基因 β-geo在該品系小鼠所有細胞和成體組織中都呈高表達，且該位點有著極高的插入效率，Rosa26位點已廣泛的運用在外源基因的定點整合中。Carreras等［12］將人的PCSK9基因插入至小鼠Rosa26位點，得到了高膽固醇血癥疾病的小鼠動物模型。2007年，Irion等［13］首次在人的胚胎干細胞基因組中鑒定出Rosa26位點。2012年，Kobayashi等［14］在大鼠基因組中同樣發現了Rosa26位點。2014 年，Li等［15］利用同源比對的方法找到了豬源Rosa26 位點，通過轉錄激活樣效應因子核酸 酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術將報告基因插入到該位點，實現了綠色熒光蛋白在豬胎兒成纖維細胞（Porcine fetal fibroblast，PFF）內的定點整合表達，并利用體細胞核移植技術得到了在Rosa26位點定點整合綠色熒光蛋白的仔豬，后經熒光檢測證實敲入此位點的報告基因在豬全身各組織器官都能高表達，證明了豬源Rosa26位點同樣是利于外源基因表達的一個友好位點。目前，利用該位點已成功開發了數種表達外源基因的轉基因動物或細胞系。

1.2 Hipp11位點

Hipp11 位點是由斯坦福大學的Hippenmeyer等［16］發現并命名，它位于小鼠基因組第11號染色體 Eif4enif1與 Drg1 基因之間，由于Eif4enif1、Drg1兩個基因的側翼序列區域具有廣泛的空間和時間表達序列標簽（Expression sequence tag，EST）表達模式，能夠使整合在此的外源基因受指定啟動子的驅動而穩定高表達，且該位點的純合敲入小鼠可正常發育和繁殖，因此Hipp11是一個表達外源基因的友好位點。介于鼠源Hipp11位點具有安全性高，無基因沉默和廣泛表達活性的特點，阮進學團隊相信豬源Hipp11位點也極具潛力，2014年，Ruan等［17］使用同源比對方法在豬基因組中找到了豬源Hipp11位點，并利用TALENs和CRISPR/Cas9等基因編輯技術對其進行了基因打靶。不僅實現對豬源Hipp11位點的鑒定，更證明該位點為豬基因組上一個表達外源基因的友好位點，這為外源基因在豬基因組內高效表達定點整合提供了新的選擇。

1.3 chr1-attP位點

眾所周知，鏈霉菌噬菌體φC31整合酶具有將attB位點與attP位點特異性結合的特點，該系統通過attB介導外源基因可以實現在attP位點的定點整合。研究表明多種真核動物體內都存在假attP位點［18-23］。在此基礎上，畢延震等［24-26］通過構建內含attB和增強綠色熒光蛋白基因（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）的報告載體與φC31整合酶表達載體共同轉染PK-15細胞系，在豬基因組中找到4個假attP位點。隨后通過顯微注射φC31整合酶mRNA和EGFP報告載體至豬一細胞受精卵中，得到了轉基因仔豬。通過對轉基因仔豬耳源組織成纖維細胞進行檢測，發現4個假attP位點中的chr1-attP位點對EGFP有較高水平的表達，從而確定chr1-attP位點是個利于外源基因高效表達的友好位點。

1.4 Pifs 501位點

Pifs 501位點是Ma等［27］于2018年分析鑒定出的1個豬源友好位點。先使用In Silico生物學方法在豬基因組中預測了多個備選位點，通過對其中評分較好的兩個位點Pifs 501和Pifs 302，使用CRISPR/Cas9介導位點特異性重組系統，將EGFP插入其中，并與pRosa26位點橫向比對，結果顯示pRosa26和Pifs 501對外源基因的表達水平均遠高于Pifs 302，盡管pRosa26對EGFP表達更高，然而Pifs 501同樣是一個有利于外源基因表達的豬源友好位點。

2 定點整合技術

要利用友好位點，就不得不提到定點整合技術。如果把友好位點比喻為“目的地”，那么定點整合技術就是到達目的地的“路徑”。當前的定點整合技術主要有以下幾種：基因編輯技術、位點特異性重組系統和轉座子系統。

2.1 基因編輯技術

時至今日，基因編輯技術已經歷3次變革，鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）［28］是最早開發使用的基因編輯系統。該系統由特異識別DNA的鋅指核酸序列和非特異性核酸切割酶組成［29］。Bibikova等［30］通過構建ZFN靶位點載體和ZFN表達載體，并將其共轉然細胞，發現了ZFNs能將基因組切割開的基因編輯能力。Perez-Pinera等［31］在2011年通過ZFNs系統配合同源重組，成功地在Rosa26位點實現外源基因的插入表達，證明了ZFNs系統可以實現外源基因的定點整合。第二代基因編輯技術TALENs又名轉錄激活樣效應因子核酸酶［32］。2014 年，李小平［33］借助 TALENs基因編輯技術實現了對豬友好位點的精確敲入。相比于前代ZFNs，TALENs具有構建更為簡單、細胞毒性更小、切割效率更高等特點［34］。Wu 等［35］利用 TALENs將小鼠的SP110基因敲入至牛基因組中，最終得到抗肺結核菌的轉基因牛抗病模型。第三代基因編輯技術CRISPR/Cas系統是學者們在研究細菌和古細菌的免疫機制中發現的［36-37］。以CRISPR/Cas9為例，早期的CRISPR系統需要crRNA（CRISPR-derived RNA）與tracrRNA（Trans-activating RNA）參與并結合Cas9蛋白表達以實現對基因組的切割［38］。而后優化的CRISPR/Cas9系統由一條單鏈sgRNA即可引導Cas9切割sgRNA靶位點區域，實現對基因組靶位點區域的定向編輯。相較于前兩代基因編輯技術，CRISPR/Cas系統更易于操作、構建簡單、效率更高。Yang等［39］在2013年使用該基因編輯技術，利用同源重組（Homologous recombination，HR）修復機制將報告基因插入至小鼠基因組中，實現了定點整合穩定表達。阮進學［40］同樣使用該基因編輯技術在細胞內引起DNA雙鏈斷裂（Double strand break，DSB），利用同源重組介導外源基因，實現了大片段基因的插入。

雖然CRISPR/Cas9利用同源重組介導能夠實現外源基因的插入，但是由于同源重組的效率極低，嚴重影響了定點整合的敲入效率。當然，同源重組只是DNA發生雙鏈斷裂之后其中一種修復途徑，非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）［41-42］修復也是其中一種。由NHEJ介導同樣可以實現外源基因的插入，美中不足的是盡管NHEJ在插入效率上遠高于HR，但它屬于一種易錯修復，會造成插入的外源基因出現缺失，因此當需要精確、高保真的定點整合外源基因時，NHEJ也非最佳的選擇。Nakade等［43］和 Sakuma等［44］提出利用微同源的末端鏈接（Microhomology-mediated end joining，MMEJ）介導的外源基因插入，并將這種方法稱為精確整合到靶染色體系統（Precise integration into target chromosome，PITCh）。實驗結果顯示，無論是利用TALENs構建的TAL-PITCh系統或是利用CRISPR/Cas構建的CRIS-PITCh系統都具備高效的外源基因插入能力。隨后Sakuma團隊［45-47］又在多種動物或細胞上證明，MMEJ具有高保真和高效率的敲入特性，是介導外源基因敲入的良好方法。

2.2 位點特異性重組系統

相較于當前使用的基因編輯技術去實現基因的定點插入，早期的定點整合主要是通過位點特異性重組系統實現的。比較有代表性的是Cre/Loxp、Flp/FRT和φC31。Cre/Loxp重組系統［48］由Loxp序列和Cre重組酶組成。Flp/FRT重組系統［49］由FRT序列和Flp重組酶組成。φC31系統［50］源于鏈霉菌噬菌體，由識別序列attB、attP和φC31重組酶組成。Cacciatore等［51］在綜述位點特異性重組系統時詳細列舉介紹了這3個系統。Cartwright等［52］利用Cre/Loxp系統成功構建了表達多種功能蛋白的小鼠模型。Bischof等［53］利用φC31特異性重組系統構建了轉基因果蠅，實現了大片段cDNA的插入。不過這3種技術均有不足，Cre/LoxP和Flp/FRT均需要在宿主基因組內“預植”識別位點，這本身就增加了操作難度。φC31整合酶的識別位點不是“唯一”的，可能帶來多位點整合，同樣為后續研究增加了復雜性。

2.3 轉座子系統

轉座子（Transposon）也稱轉座元件，是一類可以在基因組中某一位點轉移或自我復制到另一個位點從而改變它們在基因組中原有位置或增加其拷貝數的遺傳因子。轉座是一種特殊的遺傳重組，目前轉座子按其轉座的方式可以分為兩大類：一類直接以DNA到DNA的形式在轉座酶的參與下進行“剪切-粘貼”式轉座，稱為DNA轉座子；另一類則以RNA為中介，在反轉錄酶參與下完成“復制-粘貼”式轉座，稱為反轉錄轉座子。

隨著研究的深入，科研人員還創造了轉座子與基因編輯結合的系統。2017年8月，Peters等［54］發現了一類編碼在Tn7-like轉座子中的CRISPR/Cas系統。在此基礎上，2019年6月，美國麻省理工學院的張鋒研究組［55］證實了藍細菌中CRISPR-associated transposase（CAST））系統具有RNA引導轉座酶進行目的DNA插入的能力；同一時間美國哥倫比亞大學的Klompe等［56］也證明了霍亂弧菌中的一種Tn7-like轉座子相關CRISPR/Cas（Cascade）系統的基因編輯能力。兩個系統分別基于V-K CRISPR/Cas和 I-F CRISPR/Cas系統，都能實現不產生DSB的情況下將外源DNA片段定向插入到細菌基因組DNA中。兩個系統雖然都不夠完善，但是相比于利用同源重組的編輯方式在安全性和效率上都具備天然的優勢，也為基因編輯定點整合至基因組DNA提供了新的研究方向。

總的來說，雖然幾大系統都可以實現外源基因的定點敲入，但各系統還是存在著不同的優點和缺陷。就基因編輯技術而言，它的優勢是可用靶點眾多，且構建簡單。例如CRISPR/Cas9系統依靠 PAM 序列和 sgRNA 就可實現靶位點的識別；劣勢是雖然能夠實現外源基因的定點整合，但是目前多是利用HR的DNA修復方式完成，由于HR效率過低，給陽性克隆的篩選帶來了很大的難度。科研人員在后續的研究中為克服HR的低效問題陸續提出了非同源末端鏈接（NHEJ）、微同源介導的末端鏈接（MMEJ）、獨立的同源性靶向整合（Homology-independent targeted integration，HITI）［57］、同源介導的末端鏈接（Homology-mediated end joining，HMEJ）［58］等方式，但這些介導插入方式仍然存在著外源基因插入效率不夠高或是插入DNA序列保真性較差等不足。位點特異性重組系統和轉座子系統雖然存在著可用靶點少的問題，但其在插入效率上要明顯高于HR、MMEJ或NHEJ，故這些系統有其獨特的優勢。

通過基因編輯技術與位點特異性重組系統或轉座子系統之間的結合使用，先利用基因編輯技術將位點特異性系統或是轉座子系統識別序列攜帶報告基因一同插入至友好位點內，后使用位點特異性重組系統或是轉座子系統，則會較好地實現外源基因高效、高保真度的定點敲入。Zhu等［59］等就是先利用TALENs將內含φC31-attP、報告基因、Bxb1-attP序列的表達盒插入至人源細胞Hipp11位點處，又利用雙噬菌體重組酶表達載體和φC31-attB、外源基因、Bxb1-attB序列的表達載體，通過位點特異性重組系統將新的外源基因插入在位于Hipp11位點內的φC31-attP、Bxb1-attP序列中，得到表達該基因的細胞系，成功構建了一個疾病細胞系模型。這種策略先利用基因編輯技術彌補位點特異重組系統插入位點單一和敲入區域少的短板，后使用位點特異重組或是轉座子系統解決基因編輯效率低下的問題，從而實現在友好位點反復插入其他功能基因的目的。de Leon等［60］利用CRISPR/Cas9使用與Zhu課題組相同的雙整合酶盒式交換系統（Dual integrase cassette exchange，DICE），通過先CRISPR后DICE得到了表達RyR1基因的細胞系疾病模型，同樣證明了該系統的高效敲入性和在精確編輯上的巨大潛力。

3 優化順式作用元件

順式作用元件是廣泛存在于基因旁側序列中，能影響直接基因表達的序列。通過優化外源基因的順式作用元件能夠提高外源基因的表達效率，此方法主要體現在對表達載體的優化，包括優化啟動子、增強子、添加內含子、使用染色質開放元件、添加核基質附著區等。

3.1 啟動子、增強子

啟動子是RNA聚合酶進行高效準確轉錄所必須的，通常來說增強子包含在啟動子之中。現如今發現的啟動子種類有很多，像CMV、β-肌動蛋白、c-fos、U6等。如要實現外源基因的特異性表達，應選擇組織特異性或時空特異性的啟動子、增強子。Ostroweki等［61］為了實現標簽基因在呼吸系統中的特異性表達，選用了纖毛特異性啟動子作為其表達元件，最終實現綠色熒光蛋白的特異性表達。Bi等［62］對比試驗發現c-fos啟動子對綠色熒光蛋白較CMV啟動子有更高表達效能。趙芳等［63］使用肌肉特異性啟動子SP和CMV雙啟動子，成功地在肌肉組織中特異表達EGFP。Colella等［64］為實現在特異性多區域或組織器官中的表達，研究設計開發了一種串聯啟動子，這種啟動子是通過對肝細胞、肌肉細胞和神經元中的具有活性的特定組織調控元件進行組合得到的，這種串聯啟動子可實現標簽蛋白在肝臟和肌肉中高效表達。

3.2 內含子

內含子對基因表達同樣有重要的影響。事實上在選取目的基因時，使用基因組DNA或使用添加內含子的cDNA，能顯著提高該基因的表達。Brinster等［65］采用cDNA構建的載體在轉基因鼠中未能激活該基因。研究發現β-球蛋白基因在小鼠中表達時，第2內含子對于該基因的表達是必需的，從而發現內含子在外源基因的表達中具有相當重要的作用。Lu等［66］通過開發一種小內含子質粒表達載體系統，載體元件的一個通用型5'UTR中內含一小型工程內含子，該系統不僅克服了基因沉默，較使用典型小圓環DNA質粒載體相比同一外源基因的表達量提高了10倍。Gallegos等［67］系統敘述了內含子增強基因表達的一系列現象。Jaeger等［68］設計網絡工具Intronserter，利用該工具可以在cDNA作為外源基因序列中設計添加內含子，實驗證明改造后外源基因的表達量提高數倍之多。

3.3 染色質開放元件

染色質開放元件（Ubiquitous chromatin opening elements，UCOE）是內嵌于甲基化的CpG島且內含雙向啟動子的基因片段，當它連接在載體啟動子上游時，既具有染色質重塑功能，還有抵抗基因沉默的作用［69］。Boscolo等［70］發現源于人的HNRNPA2B1/CBX3基因座上的UCOE可以提高CHO細胞中重組蛋白的表達水平3-10倍。高會貞等［71］利用HNRNPA2B1/CBX3同源比對得到多個豬源UCOE序列，通過實驗篩選出了一個豬源UCOE能使報告基因綠色熒光蛋白GFP穩定高效表達，也進一步證明了UCOE具有提高外源基因表達的作用。

3.4 核基質附著區

核 基 質 附 著 區（Matrix attachment regions，MARs）又稱核骨架附著區，指的是染色體上專一的與核骨架結合的DNA序列。該序列AT含量豐富，且內含拓撲異構酶H保守序列。研究表明在載體元件中添加MAR能夠顯著地消除轉基因沉默，消除異染色質對外源基因表達的影響。李琴等［72］在2017年利用重組CHO細胞探究載體內是否含有MAR對轉基因表達的影響，結果顯示使用CMV啟動子配合β-珠蛋白MAR比無MAR配合的轉基因表達提高了2.14倍。

3.5 優化標記基因

為高效地篩選表達外源基因的陽性克隆細胞，常會使用標記基因與之共同表達。研究發現，通過弱化抗性標記基因的表達可以降低篩選濃度，減少對細胞生長速率的影響，從而獲得細胞上更高水平的重組蛋白表達。當前弱化抗性標記基因的方法主要是突變篩選標記基因降低其活性表達。劉蘇等［73］將表達載體上的新霉素磷酸轉移酶（NPT）序列中的一個天冬氨酸突變為甘氨酸，試驗結果表明突變型NPT對抗生素G418抗性減弱，其突變型細胞的EGFP表達量顯著高于野生型。

3.6 其他

除了上述幾種優化順式作用元件的方法，還有一些研究思路同樣能夠實現外源基因的高效表達。Deykin等［74］測試了在轉基因序列邊界加上轉錄終止序列（Transcription terminator sequences，TTS）是否對轉基因表達有影響。他構建了以山羊β-酪蛋白基因啟動子表達Fluc報告基因的雙順反子表達載體，對照組啟動子上游無調控元件，實驗組在啟動子上游插入染色質絕緣子（HS4）或兩個雙向TTS，結果使報告基因的表達量提高約10倍，證明了在啟動子上游加入TTS能夠促進外源基因的表達。

轉基因表達沉默是普遍存在的現象，常規質粒載體并不能解決這一問題。有報道稱，某些高含量的An/Tn片段可以消除表達系統中的基因沉默，為此Lu等［75］通過在質粒骨架中設計加入An/Tn序列組（優化An/Tn數量不改變編碼氨基酸），實驗結果表明加入An/Tn序列后，不僅阻止了外源基因的轉錄沉默，得到的表達載體具有在小鼠肝臟中持續轉基因表達的特性。

從生物安全的角度看，僅僅實現外源基因高效表達是不夠的，還應該注意衍生的問題，特別是外源基因整合過程中可能引入選擇標記，選擇標記的殘留可能造成生物安全隱患，所以在設計外源基因高效表達方案時，還應同時考慮如何處理標記，確保最終產品滿足安全要求。例如，王志蕊［76］提出的使用Cre/Loxp可以做到基因組的無選擇標記基因修飾，實現對選擇標記基因完全刪除。此外，Kim等［77］提出并證明使用微同源末端連接（Microhomologymediated end joining，MMEJ）技術同樣可以實現對選擇標記的無痕刪除。

相信隨著對基因沉默機理的深入揭示、友好位點的不斷挖掘和轉基因技術的改良和創新，通過以基因編輯技術為主的多系統靈活運用，必將把動物轉基因研究推向新的高度，更好地用于動物育種和生產。

4 總結與展望

總的來說，為了提高外源基因的表達效率，當前的策略是通過利用友好位點和優化順式作用元件等靈活疊加使用實現的。這種策略不僅克服了單一定點整合技術的局限性，更發揮了各技術的集成優勢。但就近幾年的實踐來看，仍然有幾個問題是要下力氣解決的。

一是定點整合的效率不夠高。雖然動物轉基因得益于基因編輯技術的發展，廣泛的定點整合已成為可能，但定點整合的效率依然處于較低水平。究其根源：其一，定點整合首先依賴于DNA的雙鏈斷裂；其二，在出現DSB之后，切口附近需要足夠的模板DNA引發整合。未來解決這個問題的思路應該是增大DSB的產生概率或是使用更有效的整合方式介導外源基因的插入，比如開發切割效率更高的工具酶或是找到合適的方法使DSB附近招募整合更多的模板DNA，提高引發整合的概率。

二是可用的友好位點數量較少。對基因工程動物育種來說，目前僅有Rosa26、Hipp11等少數幾個友好位點。從長遠發展看，友好位點的數量不足，不可避免會引起知識產權的沖突。另外，為追求更高效的友好位點，仍然需要在動物基因組內做深入的挖掘工作。