高效液相色譜法同時測定糖足散中4 種成分的含量

徐璐娜 夏苗芬 周玉芳 袁 強

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥學(xué)院，浙江寧波 315503；3.浙江醫(yī)院藥劑科，浙江杭州 310013

糖足散是浙江醫(yī)院中醫(yī)科應(yīng)用多年的協(xié)定處方，由當(dāng)歸、紅花、赤芍、牛膝、桂枝、細(xì)辛、乳香、桑枝、透骨草9 味中藥組成，具有活血化瘀，散寒止痛等功效，臨床上主要用于輔助治療早期糖尿病足。研究表明，糖足散熏洗在一定程度上能擴張患肢血管內(nèi)徑，加快肢端血液的運行，配合彌可保對治療早期糖尿病足有較好的臨床療效[1]。按患者的臨床癥狀及特征，中醫(yī)將其歸屬于“血痹”等痹癥范疇，常用活血化瘀藥進(jìn)行治療[2-4]。現(xiàn)藥理研究也證明活血化瘀藥能改善糖尿病微血管病變[5]。有顯著活血化瘀療效的當(dāng)歸、紅花、赤芍、牛膝，是治療糖尿病周圍神經(jīng)病變常用藥，治療下肢痹癥方面常配伍使用，有協(xié)同增效之功[6-10]。結(jié)合2015 版《中華人民共和國藥典》[11]中該4 味藥的含量測定項，故把阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、β-蛻皮甾酮作為本方質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。目前雖對各自藥材和復(fù)方制劑中的含量測定多有報道[12-17]，但尚無同時測定其含量的文獻(xiàn)。為更有效控制糖足散的質(zhì)量，本研究建立了同時測定糖足散中上述4 種成分含量的高效液相色譜（HPLC）法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津公司LC-20A 型高效液相色譜儀（配備CBM-20Alite 系統(tǒng)控制器、LC-20AT 二元泵、SIL-20A自動進(jìn)樣器、CTO-20A 柱溫箱、SPD-M20A 紫外檢測器、LC solution 色譜工作站）。

1.2 試藥

對照品羥基紅花黃色素A（批號：111637-201609）、芍藥苷（批號：110736-201842）、阿魏酸（批號：110773-201614）、β-蛻皮甾酮（批號：111638-201706）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度分別為91.9%，97.4%，99.0%，98.4%。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水（娃哈哈純凈水）。當(dāng)歸等9 味中藥飲片均購于寧波市四明大藥房，經(jīng)浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥學(xué)院花慧教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、β-蛻皮甾酮對照品適量，分別加70%甲醇制成貯備液（質(zhì)量濃度分別為483.3940、493.3310、201.9600、199.1616 μg/mL）。精密移取貯備液羥基紅花黃色素A 對照品1 mL，芍藥苷對照品5 mL，阿魏酸對照品1 mL，β-蛻皮甾酮對照品2 mL，置10 mL容量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為48.3394、246.6655、20.1960、39.8323 μg/mL）。所得溶液4℃密封保存。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取當(dāng)歸等中藥飲片適量，分別粉碎成粉末（過3 號篩），按糖足散處方中比例混勻，作為供試品。取供試品粉末約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，稱重，混勻，靜置30 min，超聲處理30 min，放冷，稱重，用70%甲醇補足減少的分量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例，制備缺紅花、赤芍、當(dāng)歸、牛膝的陰性樣品。按“2.1.2”項方法操作，即得。

2.2 色譜條件

SilverSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～5 min，10%A；5～14 min，10%～13%A；14～42 min，13%～16%A；42.01 min，90%A；42.01～58 min，90%A），流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長240 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 取“2.1”項下3 種溶液各10 μL，按“2.2”項下色譜條件測定。結(jié)果各成分峰分離良好。見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系 按“2.1.1”項下方法制備混合對照品溶液，然后逐級稀釋得一系列不同濃度的對照品溶液。按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積-對照品質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。各對照品線性相關(guān)系數(shù)（r）在0.9995～1.0000 之間，其線性關(guān)系良好。見表1。

2.3.3 精密度試驗 取混合對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、β-蛻皮甾酮RSD 分別為0.77%、0.11%、0.17%、0.14%。試驗結(jié)果表明儀器精密度良好。

表1 4 種對照品的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取混合對照品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，其RSD 分別為羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、β-蛻皮甾酮RSD 分別為0.76%、0.23%、0.23%、0.25%。表明各對照品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗 按照“2.1.2”項制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和β-蛻皮甾酮峰面積RSD 分別為0.10%、0.08%、1.75%和0.82%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量（羥基紅花黃色素A，1.6277%；芍藥苷，3.0 643%；阿魏酸，0.0507%；β-蛻皮甾酮，0.0769%）的糖足散供試樣品6 份，每份0.75 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，分別加入各對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣分析，計算回收率。見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.4 樣品測定

取3 批不同批號的各味中藥飲片，按“2.1.2”項下制備工藝制備糖足散樣品3 批，分別制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，按干燥品計算樣品中待測成分含量。見表3。

表3 不同批號糖足散中各成分的含量（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選

考察50%、70%和100%甲醇溶液提取溶劑，以及超聲20、30、40 min 提取時間，發(fā)現(xiàn)70%甲醇超聲提取30 min 時效率最高。

3.2 洗脫系統(tǒng)的選擇

考察甲醇-0.1%磷酸，甲醇-0.2%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.2%磷酸不同洗脫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸為洗脫系統(tǒng)時，分離效果較好。

3.3 色譜柱的選擇

考察不同長度的SilverSil C18色譜柱對4 種成分的影響，發(fā)現(xiàn)SilverSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離效果較好。

3.4 檢測波長的選擇

通過光譜掃描和2015 版《中華人民共和國藥典》[11]里對4 種待測成分含量測定時給定的波長，選出230、240、250 nm 進(jìn)行考察。綜合考慮各檢測成分峰面積大小、方中比例、檢測靈敏度等，最終確定240 nm 作為檢測波長。

3.5 制備工藝的改進(jìn)

目前對糖足散的制備工藝，除“研磨為粉”，并無更細(xì)化的規(guī)定，譬如粉碎的細(xì)度等。曾對成品糖足散觀察檢測，發(fā)現(xiàn)同一批次粉末粗細(xì)度不均，含量差異較大。故“2.4”項的樣品，沒有選用浙江醫(yī)院的成品糖足散，而是按特定制備工藝自制了3 批樣品。

3.6 展望

桂枝、細(xì)辛能散寒止痛，是治療痹癥的常用藥[18-20]，與活血化瘀藥相輔相成，配伍應(yīng)用后能有效改善糖尿病周圍神經(jīng)病變[21-24]。筆者在近期實驗中發(fā)現(xiàn)，調(diào)整優(yōu)化現(xiàn)有條件，有望同時分析桂皮醛、細(xì)辛脂素和上述4種成分。