不育男性抗苗勒管激素與生殖激素及精液質量參數關系的研究

陳偉文，楊龍，吳榮海，黃黎明，陳振翅，黃昌平，徐煒，廖勇彬*

(江門市中心醫院1.泌尿外科；2.檢驗科；3.生殖中心，江門 529030)

男性不育癥是一種發病率較高的男科疑難疾病。全球約5%～35%的家庭存在不孕不育問題，其中男方因素約占30%[1]。因此，必須加強男性不育的基礎及臨床研究。抗苗勒管激素(AMH) 是一種二聚體糖蛋白，由睪丸支持細胞分泌，以旁分泌作用于生精細胞，對生精細胞的成熟分化有著重要作用[2]。胎兒時期，AMH主要抑制苗勒管的發育并使中腎管發育為男性生殖管道[3-4]。目前AMH與性器官發育異常關系比較明確，與男性不育關系是近年研究的熱點。因此，本研究探討精漿和血清AMH與血清生殖激素及精液參數的關系，希望為精液異常所致的男性不育患者的治療提供參考及幫助。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年9～12月來我院生殖中心就診和咨詢的男性不育患者。常規詢問患者病史，記錄患者不育年限、身高、體重及睪丸總體積；行生殖系統體格檢查，測定患者的精液參數，檢測其精漿和血清中的AMH，同時檢測血清FSH、LH、PRL、T及E2。納入標準：(1)有規律性生活的男性不育患者；(2)男性性功能正常，可以手淫取精者；(3)對本研究知情同意，能積極配合研究。排除標準：(1)染色體異常、接觸有毒、放射性物質患者；(2)既往有隱睪、睪丸扭轉、睪丸腫瘤等手術史；(3)近3個月性激素或抗性激素治療及全身或生殖系統感染患者；(4)患有影響生育的疾病(如尿道下裂、輸精管異常、嚴重的精索靜脈曲張、隱睪癥、腫瘤等)。

本研究通過江門市中心醫院倫理委員會同意批準，所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣本采集：男性在禁欲3～7 d后，于上午(8：00 am～10：00 am)靜脈抽血，血標本送檢驗科測定血清AMH、FSH、LH、PRL、T、E2。患者在舒適環境下使用手淫法采集精液，將精液射入干燥清潔廣口器皿，立即送至生殖中心實驗室。稱重，37℃恒溫箱中充分液化，然后進行精液常規及精子質量相關參數分析。用一次性吸頭吸取1.5 ml精液，置于7 000 r/min離心機中離心3 min，取上層清液至干潔容器后進行精漿激素AMH測定。

2.激素檢測方法：血清和精漿AMH采用AMH試劑盒(批號30151601，羅氏，美國),通過羅氏Cobas e602分析儀電化學發光法檢測；血清FSH、LH、PRL、T和E2采用西門子ADVIA centaur XP分析儀直接電化學發光法檢測，試劑盒均購自西門子醫學診斷產品(上海)有限公司。所有激素項目測定嚴格按照說明書操作，激素靈敏度、最大濃度、批內變異系數及批間變異系數詳細見表1。

表1 激素檢測靈敏度、最大濃度、批內變異系數及批間變異系數

3. 精液參數分析：精液常規利用Sperm Class Analyzer(SCA)運動能力和濃度檢測模塊進行圖像采集和精液分析，參照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊(第五版)》(以下簡稱《WHO-5》)判斷檢測結果，每一份標本觀察10個視野。主要包括精子濃度、前向運動精子(PR)百分比(%)等。精子形態分析根據《WHO-5》形態學嚴格判讀標準及操作程序，采用改良的巴氏染色方法，每次計數200條以上精子，計算精子正常形態率，讀片采用人工分析(技師已參加新版手冊專業培訓)；頂體酶采用WHO推薦的改良Kennedy法測定；精子DNA完整性采用吖啶橙染色法。檢測試劑盒均購自深圳華康生物醫學工程有限公司。

4.分組：參照《WHO-5》標準，根據精液參數分為4組：少精子癥組(n=15)：精子濃度<15×106/ml，PR>32%；弱精子癥組(n=26)：精子濃度>15×106/ml，PR<32%；少弱精子組(n=31)：精子濃度<15×106/ml，PR<32%；正常精子組(n=35)：精子濃度>15×106/ml，PR>32%。

三、統計學分析

結 果

一、一般情況比較

共納入男性不育患者107例，年齡22～45歲。各組患者間年齡、禁欲天數、精液體積、不育年限、體重指數(BMI)、睪丸總體積等差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 一般情況比較(-±s)

二、血清生殖激素水平比較

單因素方差分析顯示，不同組間血清FSH和T水平存在顯著性差異(P<0.05)，LH、PRL及E2水平則均無顯著性差異(P>0.05)。LSD法進行多重比較提示，少弱精子組血清FSH水平顯著高于弱精子癥組、正常精子組(P<0.05)，而與少精子癥組無顯著性差異(P>0.05)，少精子癥組、弱精子癥組和正常精子組兩兩比較無顯著性差異(P>0.05)；正常精子組血清T水平顯著高于少精子癥組、弱精子癥組和少弱精子組(P<0.05)，少精子癥組、弱精子癥組和少弱精子組兩兩比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

三、血清和精漿AMH的結果分析比較

Kruskal-Wallis多重檢驗顯示，精漿AMH水平組間差異顯著(P<0.05)，血清AMH水平則無顯著性差異(P>0.05)。正常精子組精漿AMH水平顯著高于少精子癥組、少弱精子組(P<0.05)，但與弱精子癥組無顯著性差異(P>0.05)，少精子癥組、弱精子癥組和少弱精子組兩兩比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 各組血清生殖激素水平比較[(-±s)]

注：采用單因素方差分析LSD法多重比較提示組間差異顯著，▲P<0.05；與少弱精子組比較*P<0.05；與正常精子組比較，#P<0.05

表4 各組血清和精漿AMH的比較[M(QR)]

注：采用Kruskal-Wallis多重檢驗進行組間多重比較，▲P<0.05；與正常精子組比較，*P<0.05

四、精漿AMH、血清AMH與血清生殖激素的相關性分析

相關性分析顯示，血清AMH與精漿AMH無相關性(P>0.05)，與血清FSH、LH、PRL、T、E2亦無相關性(P>0.05)；精漿AMH與血清FSH、LH呈負相關(P<0.05)，與血清T呈正相關(P<0.05)，與血清PRL、E2不相關(P>0.05)(表5)。

五、精漿AMH、血清AMH與精液參數的相關性分析

相關性分析顯示，血清AMH與精液參數無相關性(P>0.05)；精漿AMH與精子濃度、精子總數、PR呈正相關(P<0.05)，與精液體積、正常精子形態率、頂體酶活性及精子DNA完整性不相關(P>0.05)(表6)。

表5 精漿AMH、血清AMH與血清生殖激素的相關性分析

注：Spearman相關性分析，*P<0.05

表6 精漿AMH、血清AMH與精液參數的相關性分析

注：Spearman相關性分析，*P<0.05

討 論

AMH能促進具有分化成輸卵管、子宮和陰道上段潛能的男性胎兒苗勒氏管的退化[5]，是轉化生長因子β(TGF-β)超家族成員之一。在男性胎兒的第8周，睪丸的未成熟支持細胞開始表達分泌AMH，在男性性腺發育及性分化有重要的作用[4]。在未見睪丸的新生兒中，它常常用于鑒別患兒是無睪丸還是隱睪[5-6]。出生后3～12個月的嬰兒AMH處于最高水平[7]，這可能與支持細胞增殖活躍有關[8]；青春期前，由于睪丸支持細胞處于未成熟階段，體內AMH保持較高水平，生精細胞停留在減數分裂前期。在青春期AMH下降到低水平并保持相對穩定，這可能是由于睪丸間質細胞進一步分化，開始大量分泌T，促進睪丸支持細胞成熟，使生精細胞進入減少分裂，這時T對AMH的抑制大于FSH對其促進作用，最終導致AMH表達迅速下調至嬰兒期的3%左右[7，9]。青春期后成年階段AMH維持在較低水平[10]。生育期AMH水平隨年齡的增長而下降[11]。

精子發生是一個激素依賴連續不斷增生和分化的過程，主要通過下丘腦-垂體-性腺軸實現。LH作用于睪丸間質細胞(Leydig cells，LCs)，促進T的合成。FSH與睪丸支持細胞(Sertoli Cell，SCs)的FSH受體結合，與T共同調節精子的發生[12]。本研究顯示FSH與精漿AMH水平呈負相關，這可能在轉錄因子SOX9、SF1、GATA4以及NF-κB和AP2的作用下，FSH參與激活Gsα蛋白，影響腺苷酸環化酶和蛋白激酶A(PKA)活性進而影響AMH水平[13-15]。本研究發現精漿AMH與LH呈負相關，因為AMH可刺激LH脈沖分泌，AMH變動可引起LH變動[16]，也可能通過下丘腦-垂體-性腺軸引起LCs功能失常，導致T生成異常，最終不利于精子發生。本研究觀察到精漿AMH水平與血清T呈正相關，這可能是因為血清AMH通過下丘腦中AMH受體的作用，參與到下丘腦-垂體-性腺軸的調節[16]，而睪丸局部的AMH通過LCs上的AMH受體對其發揮一定的作用，影響到T的分泌，而T是維持精子發生所必需，通過細胞內雄激素受體(Androgen receptor，AR)介導精子發生過程，在沒有T或缺乏功能性AR的環境下，精子發生減少，故AMH可通過影響T水平引起生精障礙。因此，AMH可激活Smad信號通路影響促性腺激素分泌，通過內分泌激素相互作用最終影響生精過程。

SCs產生AMH并能夠雙向分泌AMH，頂端向生精小管管腔分泌，向基底分泌則進入組織或血液循環，青春期后優先向頂端分泌[9]。由于血睪屏障的存在，使得AMH等大分子物質難以透過屏障而進入血液循環。所以，男性血清AMH與精漿AMH不存在相關性，血清AMH不能很好地預測精子發生[17]，與精子質量參數無相關關系(P>0.01)[17-19]，本研究也得出類似結果。此外，進入循環的AMH又受到全身性血漿的稀釋作用。所以，精子發生過程中精漿AMH水平要明顯高于血漿AMH水平[9]。睪丸組織產生的激素隨著精液，通過射精由生殖道排出體外，其檢測便捷且無創傷。所以探究精漿激素水平，比血清能更好地反映睪丸組織微環境中真實的激素水平狀態，能更好地了解睪丸的生精狀況，對患者診治有著重要意義。

Andersen等[19]對94名來自普通人群的志愿者和32名不育男性進行研究發現，精漿AMH與精子濃度、精子總數及PR精子百分率存在相關性(P<0.01)。本研究中，正常精子組的精漿AMH濃度顯著高于少精子癥組和少弱精子組，且差異有統計學意義(P<0.05)；相關性分析發現精漿AMH與精子總數、精子濃度及前向運動呈正相關；與以往報道[17-19]結果相近。Majumdar等[20]通過小鼠實驗發現，AMH對胚胎期及出生后小鼠精原細胞的發育有著重要作用。AMH可作用于SCs，并使其產生干細胞因子(stem cell factor，SCF)，而SCF又是SCs發育的重要調節因子。SCF通過激活PI3K信號轉導途徑，進而調節精原細胞的自我更新、增殖和分化。不同濃度的AMH對SCs產生不同效果。Anttonen等[21]使用不同濃度的rh-AMH去處理小鼠SCs，發現10～50 ng/ml低濃度的rh-AMH可通過激活細胞外信號調節激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)信號轉導途徑，促使SCs的增殖；然而50～800 ng/ml高濃度的rh-AMH，通過干擾細胞凋亡信號轉導通路，使凋亡基因Caspase-3等表達上調和抗凋亡基因Bcl-2表達下調，最終促進了SCs的凋亡。另外，Rehman等[22]也發現低濃度的rh-AMH能夠激活絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族中非經典ERK信號傳導路徑，增加SCF mRNA和SCF蛋白表達水平。有研究以重組人FSH治療特發性少弱畸精癥，發現治療有效患者的精漿AMH基線水平明顯高于無效組，治療后能提高患者AMH，暗示檢測精漿AMH能預測患者的藥物治療效果[23]。此外Nery等[24]研究認為精漿AMH還有助于維持精子活力，可以作為評估弱精子癥患者冷凍后復蘇的精子質量指標之一。

因此，男性不育患者精漿AMH與部分精液參數存在一定的相關性。由于SCs在睪丸結構上起到支持、屏障作用，在功能上起到免疫豁免，以及在精子保護、排出、營養供給方面都起到重要作用，而AMH由SCs產生，并反作用于SCs。在適宜的濃度范圍內，隨著精漿AMH濃度的升高，精子濃度、PR%等精液參數會隨它升高而提高。所以，檢測精漿AMH能反映睪丸支持細胞數目及功能狀況，一定程度上反映患者睪丸的生精功能。但是，本研究課題僅限于單一中心研究，且樣本量較小、研究時間較短，需進一步擴大樣本量、多中心、基礎及臨床研究，探討精漿AMH與精子質量的關系以及AMH在精子發生中的作用，從而制定合適的醫學參考值，指導男性不育診治工作。