睪丸冷凍精子對卵胞漿內(nèi)單精子注射胚胎質(zhì)量的影響

黃菊，黃莉，羅銘，汪李虎，黃翠玉

(廣東省婦幼保健院，廣州 511442)

無精子癥患者是男性不育的重要因素之一，在男性發(fā)生率約1%，而占不育患者的10%～15%左右[1]。這類患者需要做睪丸或者附睪診斷性取精(testicular sperm aspiration，TESA；percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)，確定有精子后，通過卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術獲得自己的后代。既往一般是在女方取卵日再次行經(jīng)皮睪丸穿刺或者經(jīng)皮附睪穿刺取精，用新鮮睪丸/附睪精子行ICSI，而本中心一直使用經(jīng)皮睪丸穿刺取精行ICSI。隨著冷凍技術的發(fā)展，冷凍診斷性睪丸取精時的微量睪丸精子成為可能。復蘇睪丸冷凍精子行 ICSI為該類患者打開一扇新的大門，避免了再次的睪丸穿刺手術及反復睪丸穿刺帶來的損傷，減輕了患者的痛苦。本研究擬對冷凍睪丸精子與新鮮睪丸精子行ICSI的胚胎質(zhì)量及遠期結局進行比較，以評價睪丸冷凍精子對胚胎質(zhì)量的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2018年4月在本中心行TESA-ICSI治療的281對患者夫婦的臨床資料。其中行診斷性睪丸取精時冷凍保存精子，復蘇后行ICSI患者165例(冷凍組)；取卵日新鮮睪丸取精行ICSI患者116例(新鮮組，既往外院行睪丸穿刺有活精子或本院行睪丸穿刺有精子但未冷凍睪丸精子)。納入標準：(1)男方為無精子癥患者，穿刺睪丸有精子；(2)女方均為首次行TESA-ICSI并行胚胎移植；(3)女方卵巢功能正常。排除標準：(1)患者信息不全或缺失；(2)女方有嚴重影響胚胎種植的因素：嚴重輸卵管積水、子宮腺肌癥、宮腔粘連、子宮畸形；(3)PGD/PGS周期。

二、研究方法

1.卵巢刺激：使用常規(guī)促排卵方案(黃體中期長方案或拮抗劑方案)，予促性腺激素刺激卵巢，促使多個卵泡發(fā)育，持續(xù)B超及性激素監(jiān)測卵泡發(fā)育，當至少3個卵泡徑線≥17 mm或2個卵泡徑線≥18 mm，且至少60%的卵泡≥15 mm時，于當晚注射HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)6 000～10 000 U或重組HCG(艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg，35～36 h后取卵。在B 超引導下經(jīng)陰道穹隆穿刺取卵。去除卵冠丘復合物外的顆粒細胞，MⅡ期成熟卵母細胞待行ICSI。

2.精子獲得：常規(guī)消毒和局麻后，固定好待穿刺的睪丸，將穿刺針刺入睪丸，取2～3個不同方位，采用Shulman的睪丸精子抽吸術獲取睪丸液和少許曲細精管，注入G-MOPS-PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)混勻備用，取微量混懸液置于高倍顯微鏡下觀察精子，盡量選擇活動精子，無活動精子則選擇形態(tài)正常的成熟精子。取卵后4～6 h行ICSI。

3.睪丸精子冷凍與復蘇：(1)冷凍：在裝有精子混懸液的試管中逐滴加入等量預先平衡到室溫的精子冷凍液(Sperm Freeze Solution，Vitrolife，瑞典)，分裝到凍存管(0.5 ml/支)中，室溫下靜置10 min，將凍存管水平放置漂浮在距離液氮表面1～3 cm的泡沫板上懸浮30 min，最后浸入液氮內(nèi)保存。(2)復蘇：將待復蘇精液樣本從液氮中取出，迅速置于37℃水浴30 s，取出至室溫后直接洗滌，300g離心 5 min，除去上清，沉淀重懸于0.5 ml G-MOPS-PLUS中，放置37℃恒溫箱，備用。

4.受精判斷、胚胎質(zhì)量判斷：ICSI后16～18 h觀察受精情況，若觀察到雙原核和兩個極體則判斷為正常受精。然后在體外繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于取卵后第3天根據(jù)Peter評分系統(tǒng)進行卵裂期胚胎評分。優(yōu)質(zhì)胚胎為卵裂球數(shù)目≥6個，碎片小于20%。

5.胚胎移植：所有移植周期均為首次移植胚胎。(1) 新鮮周期移植：取卵后第3天選擇優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎移植或者第5～6天選擇優(yōu)質(zhì)囊胚移植；(2)如新鮮周期取消移植，則行凍融胚胎移植(FET)：①自然周期：月經(jīng)周期規(guī)律的患者，監(jiān)測排卵，排卵后第4天移植D4胚胎，排卵后第5天移植囊胚；②人工周期：月經(jīng)不規(guī)律或就診不方便患者，予補佳樂2～3 mg bid，7 d后再予補佳樂3～4 mg bid，7 d后內(nèi)膜7 mm以上時予黃體酮轉化內(nèi)膜，內(nèi)膜轉化后4 d移植D4胚胎，內(nèi)膜轉化后5 d移植囊胚。

6.妊娠確定：移植術后2 周時測定血β-HCG，若陽性再2 周后行超聲檢查，宮內(nèi)見孕囊結構，則為宮內(nèi)妊娠，診斷為臨床妊娠。已確定為宮內(nèi)妊娠，孕28周之前發(fā)生的流產(chǎn)，診斷為流產(chǎn)。HCG 陽性，宮內(nèi)未見孕囊，宮外見孕囊或混合回聲包塊聲像，或進一步行腹腔鏡手術確證，診斷為異位妊娠。妊娠28周后出生活胎為活產(chǎn)。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般資料

本研究共納入281個ICSI周期，其中冷凍復蘇睪丸精子行ICSI的有165周期(冷凍組)，新鮮睪丸精子行ICSI的有116周期(新鮮組)。冷凍組男方平均年齡為(31.3±5.2)歲，新鮮組男方平均年齡為(32.0±5.9)歲；冷凍組女方平均年齡為(28.9±4.4)歲，新鮮組女方平均年齡為(29.4±4.2)歲，兩組比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。比較兩組不孕年限、促排卵Gn用量及Gn天數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組一般情況比較[(-±s)，M(P25，P75)]

二、受精、胚胎情況及妊娠結局

兩組的獲卵數(shù)、成熟卵母細胞數(shù)、D3可利用胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。冷凍組的正常受精率高于新鮮組的正常受精率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在移植胚胎數(shù)相當?shù)那闆r下，兩組的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率及低出生體重周期率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組實驗室數(shù)據(jù)及妊娠結局比較[(-±s)，M(P25，P75)，%]

注：與冷凍組比較，*P<0.05

討 論

無精子癥是男性不育的重要因素之一，隨著輔助生殖技術的發(fā)展，通過PESA或者TESA，結合ICSI技術，為無精子癥患者擁有自己的后代提供了可能性。對于該類患者來說，通過PESA或者TESA技術獲得精子意義重大，在診斷性TESA時冷凍保存這些微量精子，待后續(xù)復蘇行ICSI助孕，不僅可以避免多次手術取精導致的血睪屏障受損，而且可以減輕患者的經(jīng)濟負擔、精神壓力及反復穿刺手術的痛苦。但是睪丸精子相對射出精子，其數(shù)量少、尾部纖弱、活力差，經(jīng)冷凍復蘇后，不可避免地造成精子的進一步損傷。雖然目前冷凍技術不斷完善，但仍有多個體外實驗研究表明冷凍保存的精子可能因為滲透壓的改變、細胞內(nèi)冰晶形成及氧化應激反應等因素會損傷精子的質(zhì)膜、頂體、DNA完整性，增加DNA碎片率及損傷線粒體膜，從而導致復蘇后的精子活力及部分功能受損[2-3]。Thompson-Cree等[4]對88對夫婦進行研究，也認為冷凍精子經(jīng)過慢凍快融，會損傷精子核DNA。睪丸精子冷凍復蘇后是否會影響到精子的質(zhì)量、ICSI受精率、胚胎質(zhì)量及后續(xù)胚胎和胎兒的發(fā)育等還需進一步探討。

本研究結果顯示冷凍睪丸精子的正常受精率低于新鮮精子行ICSI的受精率(64.3% vs. 67.6%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，也一步驗證了冷凍及復蘇過程中溫度和滲透壓的變化對精子產(chǎn)生了一定的損傷，如精子的細胞膜完整性受損、DNA碎片增加、脂質(zhì)過氧化、細胞骨架改變等[5]。但兩組之間的優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率、可利用胚胎數(shù)、囊胚形成率等均無顯著性差異(P>0.05)，可能經(jīng)過冷凍復蘇的過程后，活力差、形態(tài)差、遺傳物質(zhì)受損的精子進一步被篩選剔除了，而代謝活力更好、精子膜更穩(wěn)定、染色體正常的精子存留下來[6]，所以后續(xù)的優(yōu)胚數(shù)、可利用胚胎數(shù)、囊胚形成率等均不受影響。特別是兩組的囊胚形成率(65.2% vs. 60.6%)相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，也進一步表明冷凍睪丸精子正常受精后并未影響胚胎的發(fā)育潛能，本研究結果與國內(nèi)外學者報道[7-10]基本相符。

本研究進一步針對兩組的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率及活產(chǎn)率、早產(chǎn)率、低出生體重周期率進行了比較，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但睪丸冷凍精子是否對后代的生存發(fā)育產(chǎn)生更遠期的影響，仍有待進一步研究。Karacan等[11]的研究認為新鮮睪丸精子與冷凍睪丸精子行ICSI的受精率(70.7% vs.67.3%)，臨床妊娠率(31.3% vs.25.5%)及活產(chǎn)率(28.9% vs.23.2%)均無顯著性差異，其統(tǒng)計數(shù)據(jù)提示睪丸冷凍精子的臨床妊娠率及活產(chǎn)率相對于睪丸新鮮精子而言仍稍偏低。Nicopoullos等[12]對冷凍的附睪精子與新鮮精子行ICSI研究結果表明，受精率、臨床妊娠率及種植率無統(tǒng)計學差異。Yu等[13]通過納入了17項研究、1 261個ICSI周期的Meta分析表明，非梗阻性無精子患者新鮮睪丸精子和冷凍睪丸精子行ICSI，兩組結局無顯著性差異。本研究基本與既往研究相符，進一步說明冷凍微量睪丸精子正常受精后對胚胎的發(fā)育基本沒有影響，對胎兒在母體內(nèi)的發(fā)育存活也無明顯影響，但對后代遠期的影響尚未可知。

另一方面，在精子冷凍-復蘇或處理過程中提高精子質(zhì)量也是一個探索方向，有報道表明在冷凍過程中加入褪黑素可降低氧化損傷和增加熱休克蛋白90，提高精子的質(zhì)量[3，14]；有研究顯示在精子冷凍過程中加入維生素E和B12，可以一定程度上緩解凍融過程對精子造成的傷害，提高復蘇精子活動力、存活率及改善精子DNA完整性[15]；也有報道涉及其他蛋白、氨基酸或輔酶等抗氧化劑，加入后可改善冷凍精子質(zhì)量[16]；或者根據(jù)臨床需求及實際精子制備液的要求，可針對性選擇不同的精液優(yōu)化方法以提高精子的質(zhì)量[17]。

隨著冷凍技術的不斷完善和發(fā)展，本中心行冷凍微量睪丸精子的例數(shù)也逐漸增加，研究數(shù)據(jù)提示睪丸冷凍微量精子復蘇后行ICSI，正常受精率會更低，但正常受精后，胚胎質(zhì)量及胎兒在母體的發(fā)育存活沒有明顯影響，且能減輕患者進行反復穿刺睪丸手術的痛苦，并減少對睪丸再次損傷。但本研究不足之處是樣本量不足、非隨機對照研究，且沒有對后代遠期的影響進行隨訪，尚需要進一步累計樣本量，并長期隨訪及統(tǒng)計觀察。