毓麟珠通過改善小鼠卵巢微環境防治早發性卵巢功能不全的作用機制研究

楊珍，馮遜遜，董曉英*

(1.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)

早發性卵巢功能不全(POI)是2016年歐洲人類生殖及胚胎學會(ESHRE)在女性過早卵巢功能不全的管理指南上提出的概念，是介于卵巢儲備功能下降和卵巢早衰(POF)之間的一種卵巢低反應狀態。卵巢內卵泡池減少和卵泡功能障礙是POI的典型表現，是一種嚴重的內分泌和生殖紊亂疾病[1]。臨床特點是女性在40歲前出現至少4個月以上的閉經，每月監測血FSH，出現兩次以上>40 U/L[2]。由于缺乏正常的卵泡排出，女性的月經和受孕受到影響，嚴重影響女性的生殖和身心健康。目前，POI的發病率呈上升趨勢[3]。隨著二胎政策的出臺，這一疾病引起了越來越多學者的關注。目前，激素替代療法在西方國家非常流行，但不能有效地促進卵泡的發育[4]。相反，中藥治療POI在改善卵巢功能、促進卵泡發育方面取得了良好的臨床效果，引起了眾多研究者的關注[5]。

臨床中，我們通常使用動態超聲監測卵泡。在基礎研究中，超高分辨率的動物超聲成像系統也可以無損傷地在小鼠身上完成這一過程。同時，與人體超聲一樣，超聲血流參數也可以在動物身上進行測量。在本次實驗中，我們選擇采用古方毓麟珠(《景岳全書·婦人規》)作為治療藥物，動態觀察其對免疫性POI卵巢形態、血流和卵泡發育的影響，結合卵巢微環境相關氧化因子的變化，動態、靜態綜合分析中藥毓麟珠通過影響POI小鼠中發生的氧化應激反應改善卵巢微環境，進而改善卵巢功能的作用機制。

材料與方法

一、動物和材料

1.實驗動物：SPF級BALB/c雌性小鼠7～8周齡40只，每只18～22 g，由北京維通利華技術有限公司提供(批號：SCXK 2012-0001)。

2.實驗試劑：(1)陽性對照藥：使用去離子水溶解戊酸雌二醇藥片(拜耳，德國)。根據“人與動物體表面積等效劑量比例表”1 mg/(人·d)，換算小鼠服用劑量，使溶液中戊酸雌二醇濃度為0.009 mg/ml。(2)中藥制劑：毓麟珠成分包括當歸12 g、熟地12 g、菟絲子12 g、人參6 g、花椒6 g、白術6 g、炒白芍6 g、杜仲6 g、茯苓6 g、鹿角霜6 g、川芎3 g、炙甘草3 g。飲片購自北京同仁堂科技股份有限公司。根據“人與動物體表面積等效劑量比例表”煎煮，4℃冰箱保存。確定中藥組每只小鼠按照體重每日給予中藥等效劑量0.936 g/ml，0.3 ml/只。(3)造模試劑：根據小鼠透明帶3(ZP3)的330～342個氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)合成透明帶，分析純度>90%(杭州中肽)。稱取6 mg ZP3透明帶多肽粉溶于6 ml雙蒸水中，取其3 ml與3 ml弗氏完全佐劑(F5506，Sigma，美國)混勻成免疫試劑，剩余3 ml透明帶多肽溶液與3 ml弗氏不完全佐劑(F5581，Sigma，美國)混合均勻制成免疫增強劑。

3.實驗設備：超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統MS-550 D(Vevo 2100 Imaging System，Fujifilm Visual Sonics Inc，美國)，探頭中心頻率為40 MHz，最高分辨率為40 m。軸向分辨率為40 m，橫向分辨率為90 m。捕獲深度為11 mm，增益達25 dB。

二、實驗內容

1.動物模型的建立：通過陰道脫落細胞涂片篩選出性周期正常的雌性小鼠40只。隨機選擇10只小鼠作為空白組，其余30只用于造模。每只小鼠于下腹部大腿根部、避開乳頭處皮下注射0.15 ml Zp3多肽抗原劑。14 d后，每只小鼠皮下注射0.15 ml Zp3多肽抗原增強劑。造模期間，空白組每只小鼠予以皮下注射0.15 ml生理鹽水[6]。

2.分組和管理：造模完成后將30只小鼠隨機分成模型對照組、中藥組和陽性藥組，每組10只，加上空白組10只，共4組。陰道脫落細胞涂片顯示周期紊亂提示造模成功，第15天開始灌胃。空白組和模型對照組給予生理鹽水0.3 ml，1次/d；陽性藥組每次0.3 ml戊酸雌二醇溶液，1次/d；中藥組中藥灌胃0.3 ml，1次/d，連續6周(休息1 d/周)。

3.高頻小動物超聲系統：(1)小鼠備皮與麻醉：麻醉前，先用脫毛膏去除小鼠背部及兩側探針掃描區域的背毛。脫毛完成后將小鼠置于超聲專用臺上，用麻醉面罩罩住小鼠的口鼻，調節異氟醚濃度到2.5%。麻醉后，調整小鼠體位，背部朝上呈俯趴位。將電極片附著在四肢(圖1)。超聲波平臺固定在40℃的溫度下，調節異氟醚，維持1.0%～1.5%的持續吸入量。在小鼠備皮區涂抹適量的超聲波耦合劑，避免對檢查區施加壓力。(2)超聲探頭定位與二維超聲成像：首先將探頭放置在小鼠背外右側表面上方2～3 mm處來回移動，以腎臟位于卵巢的頭部一側作為標記。探頭與小鼠身體長軸平行豎直放置即可獲得右側卵巢二維超聲圖像的縱向截面。打開“旋轉”按鈕，保存整個右側卵巢成像動態視頻(每10秒300幀)。將探頭旋轉90°，與小鼠身體長軸垂直即可獲得右側卵巢二維超聲圖像的橫斷面，使用相同的方法保存動態視頻。之后將探頭移到小鼠背外左側上方2～3 mm處，重復上述步驟，獲得左側卵巢成像。(3)卵巢血流圖像的超聲采集：將彩色采樣框架放置在小鼠背部表面對應的卵巢區域上，調整入射角顯示卵巢間質動脈。在卵巢基質中觀察到動脈血流，其光譜通過脈沖多普勒顯示采集小鼠卵巢血流圖像，記錄流速值。(4)超聲影像測量及分析：在工作站對所獲左右卵巢圖像動態視頻進行離線測量分析。二維圖像：于長軸切面測量卵巢的縱徑和前后徑，短軸切面測量卵巢的橫徑和前后徑；根據假設卵巢為橢圓體并按照橢圓體公式計算卵巢體積：卵巢體積(cm3)=縱徑×橫徑×前后徑×π/6。控制所獲取的卵巢動態視頻逐幀回放，保存每一幀圖像并計數卵泡個數及測量卵泡大小。連續記錄3～5個心動周期，分別測量卵巢動脈的收縮期峰值流速(PSV)、舒張末期流速(EDV)、阻力指數(RI)及搏動指數(PI)。

圖1 超高分辨率動物超聲成像系統檢測小鼠卵巢

4.動物血液采集：給藥6周后，心臟穿刺取血。小鼠血液標本靜止，低溫高速離心機離心3 000 r/min，取上清。小鼠腹腔V形剪開分離卵巢組織放入1.5 ml Ep管中，-80℃冰箱保存備用。

5.放射免疫測定：根據生殖激素試劑盒(南京建成)的說明，采用放射免疫法檢測血清E2、FSH、LH和AMH濃度。

6.卵巢組織中超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的測定：將子宮和卵巢組織切碎，加入蛋白裂解液，用自動研磨機將組織磨碎，4℃離心12 000 r/min，離心15 min后，吸取上清，用BCA法測定總蛋白濃度，酶標儀測定組織中MDA、SOD、GSH-Px的吸光度值，按試劑盒(南京建成生物)描述的蛋白濃度和標準曲線計算各指標的比值。

三、統計學分析

結 果

一、毓麟珠對POI小鼠卵巢面積和卵泡數的影響

給藥5周后，與空白組比較，模型對照組卵巢面積縮小，卵泡數顯著減少(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性藥組和中藥組卵巢面積均增加(P<0.05)，陽性藥組卵泡數無統計學差異(P>0.05)，中藥組卵泡數顯著增加(P<0.05)，且顯著高于陽性藥組(P<0.05)(表1、圖2)。

表1 卵巢相對值(-±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性藥組比較，△P<0.05

A：空白組；B：模型對照組；C：陽性藥組；D：中藥組。圖A中，紅色箭頭示卵巢動脈，藍色箭頭示卵泡

二、毓麟珠對POI小鼠卵巢動脈血流速度和血流阻力的影響

給藥5周后，動態監測卵巢血流。圖3中，紅色和藍色區域代表卵巢中血流的分布，結果表明，各組卵巢血流均有不同程度的變化。模型對照組血流最弱，空白組血流最強，其余血流信號介于兩組之間。從血流動力學指標看，模型對照組的脈壓差、搏動指數和阻力指數均顯著高于空白組(P<0.05)；與模型對照組比較，陽性藥組和中藥組的脈壓差、搏動指數和阻力指數均有顯著降低(P<0.05)，中藥組比起陽性藥組雖沒有統計學差異，但可以看出中藥組在降低血流指數方面具有較好的趨勢(表2)。

表2 卵巢動脈血流速度和血流阻力(-±s)

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05

A：空白組；B：模型組；C：陽性藥組；D：中藥組

三、毓麟珠對POI小鼠血清生殖激素水平的影響

與空白組比較，模型對照組FSH、LH和AMH均有顯著性差異(P<0.05)，AMH水平下降，FSH、LH水平升高，表明造模成功。與模型對照組比較，陽性藥組E2、AMH水平升高，FSH、LH水平下降，均有顯著性差異(P<0.05)；與模型對照組比較，中藥組FSH、LH水平下降，AMH水平上升，均有顯著性差異(P<0.05)；與陽性藥組比較，中藥組E2、FSH、AMH均有顯著性差異(P<0.05)，表明中藥組比起西藥雌二醇治療效果更加明顯(表3)。

四、毓麟珠對POI小鼠卵巢微環境氧化應激指標的影響

與空白組比較，模型對照組SOD、GSH-Px下降，ROS、MDA上升，均有顯著性差異(P<0.05)。與模型對照組比較，陽性藥組ROS、MDA下降，SOD、GSH-Px升高，均有顯著性差異(P<0.05)；與模型對照組比較，中藥組ROS、MDA下降，SOD、GSH-Px升高，均有顯著性差異(P<0.05)；與陽性藥組比較，中藥組ROS有顯著性差異(P<0.05)(表4)。

表3 血清E2、FSH、AMH、LH表達水平比較(-±s)

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與陽性藥組比較，◆P<0.05

表4 卵巢組織中ROS、FSH、MDA、GSH-Px和SOD表達比較(-±s)

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05；與陽性藥組比較，&P<0.05

討 論

POI是由原始卵泡的抑制和激活引起的。研究表明，卵泡發育的能量主要來自氧化反應，過度氧化引起的氧化應激反應無疑是卵巢提前老化的原因之一。ROS是氧化應激的標志之一，在調節顆粒細胞的生長、增殖和凋亡方面發揮著重要的生物學作用[7]。因此，測定活性氧相關因子及其水平，可作為判斷POI發生、發展和轉歸的依據[8]。卵巢微環境的改變引起血流周期性變化，影響卵泡發育中所需的營養物質和激素的輸送。越來越多的研究表明，卵巢微環境的氧化應激可影響卵泡的發育，這是POI的根本原因[9]。卵泡的發育依賴于卵巢和卵泡微環境中能量平衡的維持。POI患者的卵母細胞和顆粒細胞對抗ROS的能力降低[10]。ROS作為細胞損傷的生理誘導劑，是衡量氧化應激反應的重要生理指標之一。在循環的月經周期中，只有有限數量的卵泡生長發育成熟排出，大多數生長中小卵泡不會達到排卵前階段甚至經歷閉鎖，尤其是腔前和早期腔內階段的卵泡[11-12]。這些因素加在一起會導致卵巢老化。當卵巢功能衰退為生育能力下降的主要決定因素時，我們有必要擴大對整個卵巢微環境的研究。因此，研究卵巢微環境的變化對預示卵巢功能是否良好有著重要的指導作用。

毓麟珠一方首見于(《景岳全書·婦人規》)，為臨床上應用較多的調經方之一。全方12種藥，包括：菟絲子、鹿角霜、花椒、杜仲和八珍丸。全方溫補腎精，健脾生血，養血調經，注重腎陰腎陽平衡，動靜結合，補氣養血，滋補通氣，益精助孕。臨床研究發現，針對脾腎陽虛型POF的30例患者經過3～6個月給予古方毓麟珠的治療，癥狀有了顯著的緩解，血清激素水平得到了不同程度的改善，收到了較好的療效，其對月經的影響可以在停藥后依然維持，分析中藥可能調控了自身的內分泌軸[13]。基礎研究發現，毓麟珠通過上調卵泡及卵巢間質 Bcl-2 蛋白的表達，下調 Bax 蛋白的表達，抑制卵泡的過快凋亡，進而改善卵巢功能，有促進卵泡正常發育的作用[14]。

本研究結果表明，模型對照組小鼠FSH升高，AMH降低，這是判斷卵巢早衰的標準，說明POI造模成功；ROS升高，SOD降低，說明POI小鼠卵巢微環境氧平衡紊亂，發生氧化應激；高頻率小動物超聲顯示模型對照組小鼠卵巢面積縮小，卵泡數顯著減少。給藥6周后，陽性藥組和中藥組FSH降低，AMH升高，且中藥組比陽性藥組FSH及AMH水平有顯著性改善。陽性藥組和中藥組ROS降低，SOD升高，中藥組ROS比起陽性藥降低顯著，提示中藥毓麟珠可顯著改善氧化酶活性，緩解卵巢組織氧化失衡，改善卵巢微環境。

由于卵泡發育過程是動態的，因此超聲動態監測對POI的測定起著重要作用。本實驗進一步通過高頻小動物超聲動態觀察小鼠卵巢結構和血流變化，模型對照組小鼠卵巢面積縮小，卵泡數顯著減少，中藥組和陽性藥組卵巢面積和卵泡數均增加，中藥組比陽性藥組卵泡數增加更明顯，表明毓麟珠對卵泡發育的作用比西藥雌二醇的改善效果更好。高頻小動物超聲顯示中藥組小鼠卵巢血流指數均得到改善，表明毓麟珠可降低脈動指數、阻力指數和脈壓，促進卵泡微環境的改善。

綜合以上可以認為，卵巢微環境缺氧狀態改善則有利于卵泡的發育。研究表明，處方中的熟地、菟絲子、杜仲、人參等多種藥物均能提高過氧化物歧化酶活性，清除體內自由基，增強機體免疫力；當歸和川芎能改善卵巢血流量[15]。因此，我們可以得出結論：中藥毓麟珠通過改善卵巢微環境、促進卵泡發育對治療免疫性POI有積極的作用。當然，毓麟珠具體通過影響哪些環節出現這種改變及作用靶點還不清楚，我們推測，這可能與某些通路的調節有關，還需要進一步的研究。