蒲公英多糖脫色脫蛋白方法及其降血糖活性研究

郭慧靜，張偉達，陳國剛

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

蒲公英（Taraxacum mongolicum）為菊科蒲公英屬，是藥食同源的多年生草本植物，產于黑龍江、內蒙古、山西、甘肅及新疆等省區，種質資源豐富且較易獲得[1]。蒲公英除了可以鮮食以外，還可以作為藥材使用，于2014 年被國家衛生計生委列入藥食同源目錄[2-3]。鮮食蒲公英可以起到清熱解毒、消癰散結等功效；提取其功能性成分，可以有抗炎、抗腫瘤、降糖等作用；由于其藥用和食用價值日益被開發，蒲公英得到了眾多消費者的青睞。

植物多糖，是一種結構復雜的大分子化合物。大量研究表明從各種生物體內提取的多糖都具有多種藥理活性，如抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖、免疫調節和抗氧化等[4-6]功能，因此，多糖類物質的研究與開發一直是近年來的研究熱點。隨著科學技術的不斷更新，越來越多的植物多糖被研究并加工利用。多糖也是蒲公英重要的活性成分之一，已有研究表明，蒲公英多糖具有抗菌、抗腫瘤，抗氧化等作用[7-8]。然而，多糖在提取過程中通常含有部分雜質，主要包括蛋白質和色素，不僅影響多糖的生物活性，對后期多糖的分離純化和結構測定也帶來較大困難[9]。因此，研究一種脫蛋白和脫色效果較好的工藝非常重要。

本試驗以蒲公英全草為研究對象，以脫色率、脫蛋白率和多糖損失率為考察指標，對不同脫色方法和脫蛋白方法的作用效果進行比較，尋求最佳的蒲公英多糖初步純化工藝，進一步對純化前后蒲公英多糖的體外降血糖能力進行評價，考察其作為降血糖藥物的應用前景，推動蒲公英多糖在功能食品及醫藥產業中的開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英全草：采集于新疆哈密地區；粉末活性炭：廣東韓研活性炭制造有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍 G-250：美國 Sigma 公司；木瓜蛋白酶（80 000 U/g）：上海生化試劑廠；大孔樹脂：北京英萊克科技發展有限公司；α-葡萄糖苷酶、對硝基苯-β-D-葡萄糖苷（4′-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，PNPG）：上海寶曼生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、三氯乙酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-2 型數顯恒溫水浴鍋：榮華儀器制造有限公司；Multifuge X1R 型高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技有限公司；EL3002 型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-3000 型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；78-1 型磁力攪拌器：江蘇金怡科技有限公司；BK-FD12T 型冷凍干燥機：山東博科科學儀器有限公司；UV-2600 型紫外分光光度計：島津儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 分析方法

1.3.1.1 蒲公英多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[10]對蒲公英多糖含量進行測定。精確稱取葡萄糖標準品100 mg，用蒸餾水配成1 mg/mL的葡萄糖溶液。取上述溶液10 mL 配制成0.1 mg/mL葡萄糖儲備溶液，備用。分別量取儲備溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于試管中，加蒸餾水補至 2.0 mL，得到不同濃度的葡萄糖標準溶液。分別向上述各試管中加入6%苯酚溶液1.0 mL 搖勻，再沿壁迅速加入5.0 mL 濃硫酸混勻，沸水浴30 min 后取出冷卻至室溫（25 ℃），以蒸餾水作空白，于490 nm 處測吸光值。

1.3.1.2 多糖中蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍G-250 法[11]對多糖中蛋白質含量進行測定。精密稱取100 mg 考馬斯亮藍G-250，用50 mL 95%乙醇溶解，再加入85%磷酸溶液100 mL，以蒸餾水定容于1 L 容量瓶，得考馬斯亮藍染色液。稱取5 mg 牛血清蛋白溶于50 mL 0.9 %生理鹽水制成0.1 mg/mL 的標準液。分別移取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標準液于具塞試管內，用生理鹽水補到1 mL，逐管加入5 mL 考馬斯亮藍G-250 染液，混勻，25 ℃室溫條件下靜置3 min 后，在595 nm 檢測吸光值。

1.3.2 蒲公英粗多糖的制備

將采集的蒲公英清洗后50 ℃烘干，用粉碎機粉碎并過60 目篩，用石油醚回流脫脂后進行超聲輔助熱水提取，以1 ∶25 g/mL 料液比于75 ℃超聲波清洗器中，以120 W 的超聲功率浸提65 min，抽濾除去殘渣，5 000 r/min 離心10 min 取上清液，將上清液濃縮至原體積的20%，加入無水乙醇使乙醇體積分數至80%，4 ℃靜置過夜，4 000 r/min 離心 10 min 收集沉淀，分別用無水乙醇、甲醇、丙酮洗滌3 次，真空冷凍干燥即得蒲公英粗多糖。

1.3.3 蒲公英多糖脫色

1.3.3.1 活性炭法

取粗多糖配成5 mg/mL 粗多糖溶液20 mL，調節樣液pH 值為4.0，加入2%的活性炭，在50 ℃下恒溫振蕩脫色50 min，按下列公式計算多糖脫色率、多糖損失率：

多糖脫色率/%=（脫色前吸光值-脫色后吸光值）×100/脫色前吸光值

多糖損失率/%=（脫色前多糖吸光值-脫色后多糖吸光值）×100/脫色前多糖吸光值

1.3.3.2 過氧化氫法

取5 mg/mL 粗多糖溶液20 mL，調節樣液pH 值為9.0，加入10%的H2O2，在60 ℃恒溫條件下脫色3 h，計算多糖脫色率、多糖損失率。

1.3.3.3 殼聚糖法

取5 mg/mL 粗多糖溶液20 mL，調節樣液pH 值為5.0，加入5%的殼聚糖，在常溫條件下振蕩脫色1 h，計算多糖脫色率、多糖損失率[12]。

1.3.3.4 大孔樹脂吸附法

采用 AB-8 樹脂、DM301 樹脂、D101 和 NKA-9 對粗多糖進行脫色處理，比較4 種大孔樹脂的脫色效果。稱量預處理后的樹脂10 g 與20 mL 粗多糖溶液（5 mg/mL）混合，在38 ℃條件下振蕩脫色2 h，抽濾，用蒸餾水洗脫，收集洗脫液，計算多糖脫色率和多糖損失率。

1.3.4 蒲公英多糖脫蛋白

1.3.4.1 鹽析法[13]

取40 mL 脫色后的蒲公英多糖溶液，調節樣液pH值為8，加入氯化鈣粉末至10%，85 ℃攪拌10 min，冷卻后離心（4 000 r/min，10 min）去沉淀，收集上清液，按下列公式計算多糖脫蛋白率和多糖損失率：

脫蛋白率/%=（脫蛋白前蛋白吸光值-脫蛋白后蛋白吸光值）/脫蛋白前蛋白吸光值×100

多糖損失率/%=（脫蛋白前多糖吸光值-脫蛋白后多糖吸光值）/脫蛋白前多糖吸光值×100

1.3.4.2 Sevag 法

取40 mL 脫色的蒲公英粗多糖溶液6 份，設置3 次～7 次脫蛋白處理。每份多糖溶液中加入1/4 體積的 Sevag（V氯仿∶V正丁醇=4 ∶1）試劑，常溫振蕩 30 min，離心（4 000 r/min，10 min）取上層溶液測定蛋白質含量和多糖含量，并計算多糖脫蛋白率和多糖損失率。

1.3.4.3 酶-三氯乙酸（trichloroa cetic acid，TCA）法

取粗多糖溶液40 mL，加入1.2%的木瓜蛋白酶、調節pH 為5.5，50 ℃水浴3 h 進行酶解，反應后沸水浴滅活5 min，離心取上清液。加入糖質量分數為0.1%的三氯乙酸，攪拌均勻，60 ℃水浴30 min，計算酶-三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法的脫蛋白率和多糖損失率[14]。

1.3.4.4 酶-Sevag 法

取粗多糖溶液40 mL，37 ℃水浴10 min。按1.3.4.3節酶解的條件對預熱后的多糖溶液進行脫蛋白處理，對酶解后的多糖溶液按1.3.4.2 節Sevag 法再次進行脫蛋白處理，取上清液，計算酶-Sevag 法的脫蛋白率和多糖損失率[15]。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

根據文獻[16]方法并稍加修改，取濃度為0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液0.1 mL 加入2 mL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），37 ℃水浴 15 min，加入樣品溶液反應10 min 后再加入0.25 mL 25 mmol/L PNPG。水浴30 min后，加入0.1 mol/L 2 mL Na2CO3終止反應，于 400 nm 處測定吸光度（A2）；以1 mL 緩沖液替代樣品溶液，測其吸光度值為（A0）；以0.1 mL 緩沖液替代酶液測定其吸光值為（A1）。重復測定3 次，并以阿卡波糖為陽性對照。

此外，酶活力定義為37 ℃、pH 6.8 條件下，1 min內水解底物（PNPG）產生1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.4 數據分析

以上試驗均在最佳條件下操作且每組數據進行3次平行試驗，試驗結果采用3 次重復平均值±標準差（SD）表示，采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析，用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

葡萄糖及蛋白質的標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖和蛋白質標準曲線Fig.1 Standard curves of glucose and protein

以葡萄糖質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線如圖1 a，得回歸方程：Y=0.015 5X-0.009 8，式中Y 為吸光值（490 nm），X 為葡萄糖質量濃度（μg/mL），R2=0.999 6，線性范圍為 0～50 μg/mL。以牛血清蛋白質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線如圖1 b，得回歸方程：Y=0.006 2X+0.010 9，式中 Y 為吸光值（595 nm），X 為蛋白質量濃度（μg/mL），R2=0.999 2，線性范圍為 20～100 μg/mL。

2.2 蒲公英多糖脫色方法比較

4 種樹脂的性質及對蒲公英多糖脫色效果的影響見表1。

表1 不同類型樹脂的性質及脫色效果Table 1 Properties and decolorizing effect of different resins

由表1 可知，大孔樹脂S-8 是極性樹脂，對極性有機化合物吸附能力較強。蒲公英粗多糖溶液經S-8 樹脂吸附后，脫色率達到86.45%，顯著高于AB-8、DM301和D101 樹脂且多糖損失率也較低，說明蒲公英粗多糖溶液中所含色素的極性與大孔樹脂S-8 的極性相近，脫色效果較好。因此，選擇大孔樹脂S-8 作為最佳吸附介質與其它3 種方法進行比較，結果如圖2 所示。

圖2 多糖脫色方法的比較Fig.2 Comparison of polysaccharide decolorization methods

由圖2 可知，4 種脫色方法在的脫色率均在75%以上，其中過氧化氫法脫色率最高，達到93.21%。過氧化氫是強氧化劑，可以把有色物質氧化變為無色，但其氧化色素的同時多糖也容易被分解，因此損失率相對較高。活性碳因其吸附性較強，也具有較好的脫色效果，但吸附色素的同時也易吸附一定量的多糖，使得多糖損失率相對較高。采用大孔樹脂S-8 和殼聚糖進行脫色時，多糖損失率無顯著差異，但大孔樹脂脫色率更高，且樹脂可以再生重復利用。因此，采用大孔樹脂S-8 對蒲公英粗多糖溶液進行脫色。

2.3 蒲公英多糖脫蛋白方法比較

蒲公英多糖Sevag 法脫蛋白結果見表2。

表2 Sevag 法分次脫蛋白結果Table 2 The deproteinization results of polysaccharide with Sevag by different times

由表2 可知，采用Sevag 法脫蛋白時，隨著試驗次數的增加，蛋白質的脫除率逐漸增加，多糖損失率也逐漸增加。經6 次脫蛋白后，蛋白質脫除率趨于平緩。因此，采用Sevag 法脫蛋白時選擇脫蛋白次數為6 次最佳，此時蛋白脫除率為80.82%，多糖損失率為45.16%。多糖損失較多，可能是因為Sevag 試劑在使蛋白質變性沉淀的同時會造成多糖的損失，且脫蛋白次數越多，重復操作過程也使多糖的損失增加[17]。

不同方法脫蛋白結果如圖3 所示。

圖3 多糖脫蛋白方法的比較Fig.3 Comparison of polysaccharide deproteinization methods

4 種脫蛋白方法的脫蛋白率均在80%以上，其中酶-TCA 法脫蛋白效果最佳，蛋白質脫除率達到90.73%，且多糖損失率僅為22.07%。然而，TCA 在水解蛋白質的同時可能會在一定程度上破壞多糖的結構，影響多糖的活性[18]。Sevag 法多次重復也可以很好地去除蛋白質，但操作繁瑣耗時較多，且多糖損失率較高。酶-Sevag 法和鹽析法相比，多糖損失率無顯著差異（p＞0.05），且脫蛋白效果均相對較好，分別為84.09%和85.64%。綜合考慮脫蛋白率、多糖損失率、操作簡便性及對多糖結構和活性的影響等因素，采用鹽析法對蒲公英粗多糖溶液進行脫蛋白處理，進行蒲公英粗多糖的初步純化。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制能力分析

蒲公英多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力見圖4。

圖4 蒲公英多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.4 The inhibiting effects of polysaccharides from dandelion on α-glucosidase

由圖4 可知，蒲公英多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力隨著多糖質量濃度的增加逐漸增強，呈顯著的量-效關系。純化前后蒲公英多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力IC50值分別為0.65 mg/mL 和0.55 mg/mL，在質量濃度為1 mg/mL 時，抑制能力分別達到76.28%和65.16%，說明經脫色和脫蛋白后的多糖較純化前對α-葡萄糖苷酶的抑制能力增強，可能是因為蒲公英粗多糖經處理后的純度得到了提高。

3 結論

本試驗以脫色率、脫蛋白率和多糖損失率為考察指標，比較了4 種脫色方法和4 種脫蛋白方法，結果表明大孔樹脂S-8 脫色效果較好，其色素脫除率為86.45%，多糖損失率為18.9%，因此，選擇S-8 樹脂對粗多糖進行脫色處理。脫蛋白方法中，Sevag 法重復處理多糖損失率最高；采用酶-TCA 法處理時脫蛋白率最高，但TCA 會分解多糖從而增加多糖損失率并破壞其結構。因此，比較試驗結果后選擇鹽析法對脫色后的蒲公英多糖進行脫蛋白處理，脫蛋白率為85.64%，多糖損失率為20.51%。蒲公英粗多糖和經初步純化制得的精制多糖對α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用，在質量濃度為1.0 mg/mL 時，抑制率分別為65.16%和76.28%。由此可知，經本試驗篩選的脫色、脫蛋白方法切實可行，降低了粗多糖中色素和蛋白質的含量，制得的蒲公英精制多糖具有良好的降血糖活性，可為進一步研究和利用蒲公英多糖提供理論依據。