基于響應(yīng)面分析的脂肪酶在黃水酯化中的應(yīng)用研究

李怡萱，宗緒巖，陳敏，唐倩，牟婷婷，李麗

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓644000）

脂肪酶（lipase）又稱甘油酯水解酶，是一種絲氨酸水解酶類[1-2]。作為一種被廣泛使用的工業(yè)酶制劑，脂肪酶成功應(yīng)用在食品加工，醫(yī)藥、皮革、化妝品、生物材料及造紙等行業(yè)[3-4]。脂肪酶具有反應(yīng)副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、高度的底物選擇性、產(chǎn)物易分離回收、反應(yīng)速率快、綠色反應(yīng)等特點(diǎn)，能夠有效地促進(jìn)各種催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化[5]。比如：酯化、水解、轉(zhuǎn)酯、醇解、羥醛加成等反應(yīng)[6]。脂肪酶來源較廣，在植物，動(dòng)物，微生物中都有分布[7]，其中，微生物所產(chǎn)的脂肪酶具有繁殖快、來源廣、周期短、易制取、反應(yīng)條件寬泛等特性，可被大規(guī)模應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)中，酵母、細(xì)菌、放線菌、霉菌等微生物都是良好的胞外脂肪酶生產(chǎn)者[8]。在白酒行業(yè)中，脂肪酶可作為一種窖外酯化酶用于白酒增酯，提高酒質(zhì)[9]。

黃水是濃香型白酒固態(tài)釀造過程中，在微生物和酶共同作用下產(chǎn)生的一種棕黃色，黏著液體[10]，其成分復(fù)雜，含有大量的酸、醇、醛、酯等香味物質(zhì)[11]。黃水是白酒生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，產(chǎn)量較大，成分復(fù)雜。許多廠家和專家通過生物酯化技術(shù)實(shí)現(xiàn)對黃水的資源化利用[12-16]。在目前研究中，酯化制劑多是以菌酶復(fù)合物形式出現(xiàn)，其具有發(fā)酵周期較長（大于7 d），酶活低，增香效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。為克服上述問題提高酯化效果。本文采用單酶制劑為酯化劑，以黃水為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Bnheken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對發(fā)酵時(shí)間、乙醇添加量和己酸添加量3 個(gè)主要影響因子進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化黃水的酶促酯化試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃水：宜賓天成酒廠有限公司；脂肪酶（5 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、正己酸、氫氧化鈉、硫酸、酚酞均為分析純：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C 型酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；AX224ZH 型電子天平：奧豪斯儀器有限公司；NS-100B 臺(tái)式恒溫?fù)u床：上海聚萊試驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

1）總酯測定：略有改動(dòng)。取100 mL 發(fā)酵液和50 mL蒸餾水于500 mL 圓底燒瓶中，緩火蒸餾100 mL。取50 mL 餾出液于250 mL 錐形瓶中，加兩滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至粉紅后加入一定量的0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷凝皂化回流30 min，冷卻后，用0.1 mol/L H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液微紅色剛好消失，按公式（1）計(jì)算[17-18]。

式中：X 為總酯含量（以己酸乙酯計(jì)）；c1為 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1為樣品消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；c2為 H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V2為樣品消耗 H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0為餾出液體積，mL。

2）總酸測定：取2 mL 發(fā)酵液，加入蒸餾水20 mL。用0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 9。按公式（2）計(jì)算[17-18]。

式中：X 為總酸含量（以乙酸計(jì)）；c 為 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V 為樣品消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL。

3）乙醇測定：取100 mL 發(fā)酵液和50 mL 蒸餾水于500 mL 圓底燒瓶中，緩火蒸餾100 mL。取5 mL 餾出液，依次加入1 mL 20 % 重鉻酸鉀溶液，4 mL 濃H2SO4。沸水浴5 min，冷卻后于600 nm 波長處測定吸光度。乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=9.523 8x+2.655（R2=0.999 5）。y為乙醇體積分?jǐn)?shù)（mL/100 mL）；x 為 600 nm 波長處的吸光度[17]。

4）pH 值測定：使用 pH 計(jì)測定。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

量取100 mL 黃水，加酶量0.2 %，己酸添加量1.25 mL/100 mL，乙醇添加量3 mL/100 mL，反應(yīng)溫度37 ℃，酯化時(shí)間7 h。在該酯化條件下，以總酯為評價(jià)指標(biāo)，固定其他變量來研究單一因素對黃水酯化效果的影響。單因素水平如下：己酸添加量（0、0.25、0.75、1.25、1.75 mL/100 mL）、乙醇添加量（0、1、2、3、4、5 mL/100 mL）、反應(yīng)溫度（23、30、37、44 ℃）和酯化時(shí)間（1、7、13、19、25 h）。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Bnheken 原理設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)優(yōu)化試驗(yàn)，以總酯含量（Y）為響應(yīng)值，對己酸添加量（A）、乙醇添加量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）3 個(gè)影響因子進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，研究各因素交互作用和對總酯的影響，確定黃水的最佳酶促酯化條件，因素水平見表1。

表1 黃水酶促酯化反應(yīng)確定試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels of experimental factors determined by enzyme reaction

1.3.4 模型驗(yàn)證

采用Design-Expert 8.06 軟件擬合出的最佳條件進(jìn)行酯化試驗(yàn)，對比預(yù)測值與試驗(yàn)值，驗(yàn)證模型有效性。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

以上每組數(shù)據(jù)重復(fù)試驗(yàn)3 次，取平均值。Design-Expert 8.06 軟件進(jìn)行響應(yīng)面處理，方程擬合和結(jié)果分析。origin 軟件進(jìn)行單因素方差分析制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水理化指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果

黃水理化指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

通常來說，黃水的酒精度為2.00%～9.30%，pH 值為 2.50～4.00，總酸含量為 2.40 mL/100 mL～7.50 mL/100 mL，總酯含量為 2.00 g/L～4.00 g/L，乙醇含量1.91 mL/100 mL～5.40 mL/100 mL[19]。

表2 黃水的理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of yellow water

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 時(shí)間對黃水酯化效果的影響

反應(yīng)時(shí)間對黃水酯化效果的影響見圖1。

圖1 酶促反應(yīng)時(shí)間對黃水酯化效果的影響Fig.1 Effect of reaction time on esterifying

一般來說，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長應(yīng)該更有利于脂肪酶的催化反應(yīng)。但由于反應(yīng)的可逆性，長時(shí)間的催化引發(fā)的底物的消耗，產(chǎn)物的積累和反應(yīng)條件的變化都有可能導(dǎo)致酯化反應(yīng)的逆方向進(jìn)行，降低催化效果[20-21]。如圖1 所示，純脂肪酶制劑的酯化效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最優(yōu)酯化時(shí)間為7 h。

2.2.2 溫度對黃水酯化效果的影響

溫度對黃水酯化效果的影響見圖2。

圖2 溫度對黃水酯化效果的影響Fig.2 Effect of temperature on esterifying

如圖2 所示，不同的脂肪酶在同等溫度下的酯化合成能力不同，同種脂肪酶在不同溫度下酯化能力也不同。在合適的溫度范圍內(nèi)，底物分子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)能會(huì)因?yàn)橹車鷾囟鹊纳仙黾樱M(jìn)而導(dǎo)致底物分子與酶的接觸頻率的提高，宏觀表現(xiàn)在酯的合成能力的提升。但溫度對于酶促反應(yīng)的表現(xiàn)是復(fù)雜的，由于脂肪酶屬于蛋白質(zhì)，在熱作用的影響下會(huì)逐漸失活，甚至?xí)耆珕适Щ盍20-22]。總的來說，用于白酒增酯的酯化劑的最適溫度范圍為 30 ℃～40 ℃[23]。

2.2.3 底物添加量對黃水酯化效果的影響

乙醇添加量、己酸添加量對黃水酯化效果的影響分別見圖3、圖4。

圖3 乙醇添加量對黃水酯化效果的影響Fig.3 Effect of ethyl alcohol addition on esterifying

圖4 己酸添加量對黃水酯化效果的影響Fig.4 Effect of caproic acid addition on esterifying

脂肪酶在黃水體系中主要作用的底物是乙醇和短碳鏈酸（己酸、乙酸等），合適的底物濃度范圍是獲得最佳酯化液的關(guān)鍵[24-25]。一般情況下，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，由于底物分子在環(huán)境中的擴(kuò)散速率和底物與酶之間接觸機(jī)會(huì)較小，酯化合成速率較低。隨著底物濃度增加，酯化能力也隨之增加[20]。如圖3 和圖4 所示：脂肪酶在乙醇添加量在0～3 mL/100 mL，己酸添加量在0～1.25 mL/100 mL 這兩個(gè)體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，總酯值呈現(xiàn)上升趨勢。酯化反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^量后，醇和酸將作為酶的抑制劑，破壞酶的結(jié)構(gòu)，阻礙酯化進(jìn)程，造成酯化率不升反降[26]。當(dāng)己酸添加量，乙醇添加量分別達(dá)到最優(yōu)值（1.25、3 mL/100 mL）后，脂肪酶的總酯值都呈現(xiàn)下降趨勢。一般來說，黃水酯化液中乙醇的最適濃度范圍是10%～15%，己酸是一種具有較強(qiáng)極性的底物，對酶的穩(wěn)定性和活性會(huì)有顯著影響，為保證合成反應(yīng)的順利進(jìn)行，酯化反應(yīng)要在醇過量的條件下進(jìn)行[22]。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design with the independent variables

續(xù)表3 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Box-Behnken experimental design with the independent variables

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)由表3 列出的17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)組成，并且設(shè)計(jì)5 個(gè)重復(fù)用于估計(jì)試驗(yàn)誤差平方和。總酯的預(yù)測響應(yīng)值Y 通過下列的二階多項(xiàng)式方程表示：

對響應(yīng)面回歸方程方差分析的結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 4 Response surface ANOVA results

該模型的顯著性由F 檢驗(yàn)判斷，試驗(yàn)結(jié)果表明，用于擬合響應(yīng)變量的模型及顯著（P＜0.000 1，F(xiàn) =88.91），足以表明響應(yīng)值與自變量之間的關(guān)系。R2=表明該模型的擬合度良好。失擬項(xiàng)F=1.54，P=0.334 0＞0.05，不顯著，對模型有利。該模型的回歸方程不失擬，說明該回歸方程可以代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

發(fā)酵時(shí)間、乙醇添加量、己酸添加量交互響應(yīng)面和等高線圖見圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間、乙醇添加量、己酸添加量交互響應(yīng)面和等高線Fig.5 The interactive response surface and counter of fermentation time，ethyl alcohol addition and caproic acid addition

2.4 模型驗(yàn)證

Design-Expert 8.06 軟件預(yù)測最佳己酸添加量、乙醇添加量和反應(yīng)時(shí)間分別為1.69 mL/100 mL、2.98 mL/100 mL 和8.73 h。且在該條件下預(yù)測的總酯含量為5.298 g/L。在最佳條件下進(jìn)行3 個(gè)平行試驗(yàn)，測得實(shí)際結(jié)果為（5.072±0.08）g/L 實(shí)際結(jié)果與預(yù)測結(jié)果接近，這表明本試驗(yàn)可靠。

3 討論

通過單因素試驗(yàn)，得到了3 個(gè)影響因子的最佳作用范圍，對脂肪酶黃水酯化過程進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面方法中的Box-Bnheken 試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了酶促酯化條件，包括己酸添加量、乙醇添加量和發(fā)酵時(shí)間。采用二階多項(xiàng)式擬合模型，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了較好的描述。最佳酯化條件如下：己酸添加量1.69 mL/100 mL，乙醇添加量2.98 mL/100 mL，反應(yīng)時(shí)間8.73 h。針對本文的優(yōu)勢和不足，總結(jié)如下：1）單酶制劑成功解決了酯化液發(fā)酵周期較長的問題，加速了酯化反應(yīng)的進(jìn)程，提高了酯化率。但在白酒產(chǎn)業(yè)中，脂肪酶的酯化能力是針對四大酯（己酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯）的合成效果進(jìn)行研究，以總酯作為響應(yīng)值過于籠統(tǒng)，增香針對性不強(qiáng)。下一步考慮分別對白酒四大酸的合成能力進(jìn)行研究。2）工業(yè)生產(chǎn)下的最佳酯化條件能否與試驗(yàn)室條件一致，需通過中試試驗(yàn)繼續(xù)對反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證。